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免疫学检测方法 免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。本章将从抗原、抗体、免疫细胞和细胞因子检测等方面概括介绍试验的基本类型、原理和主要用途，并对分子生物学技术(分子杂交、转基因、多聚酶链反应)在免疫学领域的应用作一简要介绍。 第一节 检测抗原抗体的体外方法 抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)。试验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应(serological reaction)。 一、抗原抗体反应的特点 (一)抗原抗体结合的特异性 抗原借助表面的抗原决定簇与抗体分子超变区在空间构型上的互补，发生特异性结合。同一抗原分子可具有多种不同的抗原决定簇，若两种不同的抗原分子具有一个或多个相同的抗原决定簇，则与抗体反应时可出现交叉反应(cross reaction)。 (二)抗原抗体结合的可逆性 抗原抗体结合除以空间构型互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的非共价方式结合，结合后形成的复合物在一定条件下可发生解离，回复抗原抗体的游离状态。解离后的抗原和抗体仍保持原有的性质。抗原抗体复合物解离度在很大程度上取决于特异性抗体超变区与相应抗原决定簇三维空间构型的互补程度，互补程度越高，分子间距越小，作用力越大，两者结合越牢固，不易解离；反之，则容易发生解离。 (三)抗原抗体结合的比例性与结合物的可见性 抗原与抗体的结合能否出现肉眼可见的反应，取决于两者的比例。若比例合适，则可形成大的抗原抗体结合物，出现肉眼可见反应现象；反之，虽能形成结合物，但体积小，肉眼不可见。由于这种分子比例的差异，分别形成了三种区带现象。等价带表示抗原与抗体比例最合适，形成大而多的结合物，此时在反应体系中测不出或有极少游离的抗原或抗体；抗体过剩带(前带)和抗原过剩带(后带)皆表示抗原与抗体的比例不合适，所形成的结合物少且小，其反应体系中存在着游离的抗原或抗体。抗原抗体分子的比例与结合物大小的关系如图18.1所示。小分子可溶性抗原，因其表面积大，容易导致后带现象；而细胞等颗粒性抗原，在与抗体反应时则易出现前带现象。因此在抗原抗体检测中，为能得到肉眼可见的反应，在了解抗原的物理性状之后，对抗原或抗体进行稀释，以调整二者的比例。 图18.1抗原-抗体反应模式图 (四)抗原抗体反应的阶段性 抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段是抗原抗体的特异结合阶段，此阶段仅需几秒到几分钟、尚无可见反应；第二阶段为可见反应阶段，需数分钟、数小时乃至数日，受各种因素影响。 二、抗原抗体反应的主要影响因素 (一)抗原和抗体浓度、比例 抗原和抗体浓度、比例对抗原抗体反应影响最大，是决定性因素，如前所述。 (二)电解质 抗原与抗体特异性结合后，其亲水性减弱，分子表面所带的电荷易受电解质影响而失去，复合物间的排斥力下降，导致第一阶段已形成的可溶性结合物能进一步联结，出现明显的凝集或沉淀现象。试验中常用0.85％的NaCl溶液作为稀释液，以提供适当浓度的电解质。 (三)温度 适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会，加速结合物体积的增大，一般而言温度越高，形成可见反应的速度越快，但过高则会使抗原或抗体变性失活，影响试验结果。一般在37℃下进行试验，但也有些抗原抗体在4℃下进行反应较好。 (四)酸碱度 pH过高或过低都将直接影响抗原或抗体的理化性质。例如，当pH降至3.0左右时，因接近细菌抗原的等电点，细菌表面蛋白或其他基团所带的电荷消失，其相互间的排斥力丧失而导致非特异性酸凝集，影响试验的可靠性。 三、抗原与抗体的制备 抗原与抗体是血清学反应的物质基础。抗原的制备与纯化是获得特异性抗体的先决条件，所得到的抗体又可反过来纯化和检测抗原。 (一)抗原的制备 抗原种类繁多，按其物理性状可分颗粒性和可溶性两类。前者指细胞性抗原(包括细菌抗原)，其制备较为简便，一般用新鲜细胞以无菌生理盐水或磷酸缓冲液洗涤后配成一定浓度。若系细菌抗原，则取新鲜培养物，经集菌作如下处理，H抗原因不耐热用0.3％～0.5％甲醛处理，O抗原耐热可加热100℃2h去除H抗原后应用。可溶性抗原可以是细胞膜、细胞浆、细胞核及核膜等细胞组成部分，也可能是经细胞分泌至体液中的一些可溶性因子。细胞组成部分常需经过机械或酶解法等破碎、离心获得粗制抗原，并通过选择性沉淀或层析等方法进一步纯化。而体液中(如血清等)的可溶性抗原则可直接用生化手