PCR—SSCP技术及其应用.pdfVIP

PCR—SSCP技术及其应用 邓放 罗超 黄冬维 黄微 愈凯 (1，湖南农业大学东方科技学院检疫实验室 410128；2，湖南农业大学动物科技学院 410128) PCR聚合酶链式反应 ，是一种分子生物学技术 ．用于放 增产物变性后 ．置于碱性非变性聚丙烯酰胺凝胶 中电泳 ，空 大特定 的DNA片段 。可看作生物体外 的特殊 DNA复制 ， 间构象不同的单链 DNA会 因其迁移率不同而得到分离，从 PCR—SSCP技术是 PCR技术和 SSCP技术 的结合 ，将 PCR扩 而检测相应的遗传变异 ，PCR—SSCP经不断地改进和完善 ， 作者简介 ：邓放 (1987一)，男，本科 ，湖南长沙人 ，动植物检疫专业。 通讯作者 ：罗超 (1981一)，男，硕 士，湖 南益阳人 ，实验 员，动植物检疫专业。 蛋 白，特异性强 ，敏感性可达 104CFU／mL。但该方法操作较 rRNA基 因的引物各一对 ，扩增 出DNA产物分别为 543bp和 复杂 。而且有些单克隆抗体可与其它支原体有交叉反应 ，这 290bp，试验 的敏感性达 320个支原体 ；1992年 Sasaki等根 一 点在诊断时应予 以注意。 据等位基 因特异 的 PCR原理从 16SrRNA基 因中设计 了 2．4 基因诊 断技术 Mpn一1和 Mpn一2一对 引物该 引物 只对 Mp里阳性反应 ，与生 随着分子生物学技术的飞速发展 ，基因诊断技术在支原 殖道支原体无交叉反应 ，可测 出标本中 100个肺炎支原体 的 体检测中的地位越来越显著。常用的方法有：核酸探针杂交 存在 。PCR方法 的敏感性 明显高于其它的诊断方法 (如 技术和聚合酶链式反应 (Polymerasechain reaction，PCR) ELISA)。支原体的粘附蛋 白 (例如，Mp的P1蛋 白，Mhp的 技术 。本文重点介绍一下PCR技术。 P 蛋 白等)和支原体的 16SrRNA基因常作为 PCR的模板。 PCR是近年来建立 的一种特定核苷酸体外扩增技术 。该 在兽医方面 Fan等根据 16SrRNA基 因序列设计两个 引 方法 的特点是简便、灵敏、快速 。但迄今为止 ，国内外还没 物检测鸡毒支原体证明PCR技术 同其他方法具有 明显的优 有绵羊肺炎支原体 PCR检测方法 的报道 ，目前国内外研究应 势，在临床上是一种可靠 的诊断方法 。CamnJ等根据猪肺炎 用 PCR检测人的肺炎支原体 (Mp)的工作取得突破性进展 ， 支原体的P 和P 基因设计引物成功的用于检测猪肺炎支原 1989年 Ceile和 Bamet等首先应用 PCR技术检测肺炎支原 体。KatharinaDC等用 RT--PCR检测猪肺炎支原体进一步 体 ，应用引物 Mp5— 1和 Mp5—2扩增到 144bp的序列，可 提高了PCR的灵敏度和特异性。 测 出 10～10，CFU／mL肺炎支原体 ，引物特异性强 ，其它支原 由此 ，可以看出聚合酶链式反应用于支原体的检测越来 体和呼吸道常见细菌未见阳性反应；1992年williamson等设 越引起人们的关注 ，但是在绵羊肺炎支原体 的检测上 ，至今 计 了扩增肺炎支原体 P，蛋 白基 因序列的一对 引物和 16S 国内外还没有 PCR检测 的报道。 56 口匡目匿口 2008．11 更为简便、快速 、灵敏 ，已被广泛应用于生命科学当中。 用凝胶成像系统或数码照相机拍照 。 1 PCR—SSCP原理及 实验方法 2 优点与缺陷 1．1 实验 原理 PCR—SSCP分析法 的优点在于 ：操作简单 ．不 需要特别 单链构象多态性是指单链 DNA在溶液 中形成立体构象， 贵重 的仪器 ，技术容易掌握 ，PCR产物变性后无需特殊处理 等长 的DNA片