PCR技术在禽病诊断中应用的研究进展.pdfVIP

12 PCR技术在禽病诊断中 板。而常规分离培养需进行多次的传代增殖，时间周期 应用的研究进展 孔繁德h2 陆承平1 1南京农业大学动物医学院 310095； 2厦门出入境检验检疫局 361012 chain 聚合酶链式反应(PolymeraseReaction，PcR)，禽白血病(ALv)囊曦基因片段，该廊不同毒隐涮珊骐淠叫羊， 又称体外基因扩增技术，是80年代中期由Mullis．发明所以可用于诊断禽白血病和鉴别不同的禽白血病病毒 的一种新的分子生物学技术，与传统的检测方法如生 (ALV)毒株。 物化学、细菌学、病毒学和血清学方法等相比较，PcR 2．2 方法具有特异性和敏感性高、操作简便、快速高效等特 种脱氧单核苷酸用放射性同位素、生物素、地高辛等标 点，而且应用广泛。在病原方面，它既可作病原体的检 测，也可同时进行不同病原或同一病原不同株的检 测。特别适合难以培养的病毒和细菌的检测。经过近20 用地高辛标记的25个碱基作为探针进行斑点杂交检 RF 年的发展，目前已开发出多种PCR技术，以适应不同试 测鸡贫血因子(CAA)，表明扩增片段对CAADNA是 验需要，现综述PcR技术在禽病诊断中的应用。 l PCR原理 RF PcR是由三个基本反应组成的反复循环过程。首 细胞。至少能检出100圾的cAADNA。黄庚明等用 先，高温变性，即在95℃高温下将所要扩增的靶基因或 地高辛标记的cDNA探针，建立并优化了检测禽流感病 DNA双链解离成单链DNA；其次，低温退火，即以单链 毒核酸的探针杂交法，能辨别出非免疫鸡胚和sPF鸡 DNA为模板在37～55℃低温下与人工合成引物按碱基 配对原则相结合；最后，延伸，在耐热TapDNA聚合酶、 胚尿囊液中的病毒，攻毒后第3天的sPF和非免疫鸡 Mf+、72℃、合适缓冲液、4种dN即条件下合成互补 DNA新链，即从引物的3’一0H延伸，方向为5’一3’， 可合成二分子与模板序列完全相同的DNA。上述3个 试验检不出临床样品的AIv。 基本步骤可重复循环，每循环一次每一DNA分子增殖 2．3 反向PcR技术用于扩增位于已知序列两侧的 一次，n次循环后，增殖的DNA分子为2“个。n为循环一段未知序列，而常规PCR是用来扩增两个已知序列 次数，但因各种因素影响，实际增殖数稍低一些。按 之间的DNA片段。具体方法为先用一种能酶解已知序 列侧面的限制性内切酶消化已知序列，再利用T4DNA 75％计算，单一拷贝的基因经25—30个循环后，基因 拷贝数达10s。10，。该技术可从稀少基因片段上扩增连接酶使具有粘性末端的未知序列环化，然后用另一 DNA序列，也可用于检测扩增区细微的变异。目前已经 种限制性内切酶再切开已知序列，经过上述线状一环 开发出许多诊断试剂盒，使用十分方便。 状一再线状的变化，使原位于已知序列两侧的未知序 2 PCR技术及其在禽病诊断学中的研究进展 列变为位于已知序列的中央，这样经PcR扩增便可测 2．1 常规PCR技术以提取样品病原DNA为模板，得未知序列。利用反向PcR可对未知序列扩增后进行 在事先设计的引物、dN仰混合液、PcR反应液、Tap酶分析，适用于基因游走，转位因子和已知序列DNA旁侧 和镁离子等条件下进行的PCR反应。根据是否有扩增 病毒整合位点分析等研究。 产物，扩增产物是否与预测的目的基因片段一致对禽 2．4 病进行诊断。任红梅等利用常规PCR技术对ILTV北京是采用不等量的一对引物，若干循环后，量少的一种先 E2株、山东分离株和4个发病鸡喉气管组织的DNA进消耗完，剩下另一引物参与以后的循环