冷冻保存对野牦牛精子酶活性的影响.pdfVIP

维普资讯 中国草食动物 2007焦 冷冻保存对野牦牛精子酶活性的影响 林金杏，阎 萍，郭 宪，曾玉峰，姚玉妮 (中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，730050) 摘要：研究冷冻保存(一196oC)对野牦牛精子顶体酶等酶活性的影响。应用Giemsa染色法、BAPNA底物法、改良明胶底 膜法和磷酸苯二钠法分别测定不同保存年份的精子顶体完整率、顶体酶、透明质酸酶和酸性磷酸酶活性 ；采用酶动力学分 光光度法，分别以丙酮酸钠和 a一已酮酸钠为底物测定乳酸脱氢酶及其同工酶 C4活性，并计算C4的相对活性。结果表 明，在冷冻保存条件下，野牦牛精子有关酶活性下降；并随保存时间的延长，下降幅度增加；对保存 5年以上的精液需抽样 测定功能和品质后再用于生产。 关键词：野牦牛；精子；顶体酶；透明质酸酶；酸性磷酸酶；乳酸脱氢酶 野牦牛 (Bosmutus)是我国特有的种质资源，属于国家一级 1．3 顶体酶 (AcrosomalEnzyme，ACE或 Acrosin)活性测定 保护动物。利用野牦牛冻精对家牦牛进行人工授精，将野牦牛 BAPNA(N—a一苯甲酰一DL一精氨酸一p一硝酰基苯胺)底物 遗传基因导人家牦牛群体，从而达到复壮家牦牛的目的。精液 法口3。 冷冻保存已成为一种常规技术，但长期低温保存会导致精子活 1．4 透明质酸酶 (Hyaluronidase，HYD)活性测定 参考陆 力降低 ，部分精子死亡。精子含有一个与受精密切相关的酶系， 云L3等的明胶底膜法并稍作改 良：一定体积的0．6 (M／V)透 精子酶在哺乳动物冷冻精液的品质评定及受精过程中的调控作 明质酸钠水溶液，1／2体积的 12 明胶混匀、制成底物基质液， 用已引起有关学者的极大关注。本文通过测定冷冻前后野牦牛 取适量均匀涂抹在载玻片上，室温干燥 ，4O 甲醛固定1h，蒸馏 精子有关酶活性的变化，探讨冷冻保存对精子酶活性的影响，为 水漂洗后干燥 ，即制成基质薄膜。将精子稀释液直接涂于载玻 提高人工授精成功率和正确评估精子的受精能力提供理论依据。 片基质膜上置 37℃湿盒内温孵3h，0．02 甲苯胺兰染液染色5 1 材料与方法 min，丙酮分色3～5S。相差显微镜下观察精子头部周围是否出 1．1 精液来源 野牦牛新鲜精液和冻精均由青海省大通种牛 现圆形蛋白光轮(ProteinFreeHalo)，并计算精子HYD阳性反 场提供。鲜精通过假阴道法(40℃)采集，冻精贮存于一196℃ 应率；用测微器测量反应区光轮直径，计算平均光轮直径 (Mean 液氮中。头 前，鲜精 37℃液化30min，冻精38℃水浴解冻。 HaloDiameter，MHD)，将其作为 HYD活性强度的指标。 1．2 顶体完整军 (ProbabilityofIntegratedAcrosome，PIA)测 1．5 酸性磷酸酶(AcidPhosphatase，ACP)活性测定 磷酸苯 定 Giemsa染色法 J。 二钠法测定L4j。 1．6 乳酸脱氢酶 (LactateDehydrogenase，LDH)活性测定 鲜 收稿 日期：2006—12—14 精或解冻的精液一2O℃冷冻 1h后 ，自然融化，酶动力学分光光