MTT显色反应实验条件分析.pdfVIP

第 9卷 第 2期 河 南 医 学 研 究 V o 1.9 N o .2 2000年 6月 HENAN MEDICAL RESEARCH June 2000 文章编号：1004.-437X(2000)02-0107-05 MTT显色反应实验条件分析 赵承彦1,靖志安1,牛青霞2 (1.河南省肿瘤研究所生物医学研究室 河南郑州 450003；2.汕头大学医学院微生物系 广东汕头 515031) 摘要：目的：检验分析MTT实验方法本底高、灵敏度低、稳定性差的影响因素，改进实验条件提高灵敏度和稳定性， 降低本底。方法：用MTT比色方法，细胞毒试验及细胞增殖实验，分析比较不同条件下MTT显色反应的性能特点。 结果：比较 了13种溶剂对Formazan的溶解性能。分析检验了琥珀酸脱氢酶在细胞上的分布特点、pH值对MTT反 应体系的影响、酚红和牛血清对检验结果的影响，提出相应对策。检测了MTT反应时间曲线和细胞活力曲线。分 析 了改进后的MTT实验方法 的灵敏度和稳定性。结论：以MTT为底物的酶在细胞代谢中主要分布在细胞膜表面。 MTT反应体系的pH值为6.7,比较好的Formazan溶剂是正丙醇、异丙醇和乙二醇乙醚。去掉细胞培养上清，检测细 胞上的酶，用溶剂使蛋白质变性，经沉淀去掉蛋白质影响，能使MTT实验方法的本底降低，灵敏度提高。通常情况 下该方法检测K-562细胞和人淋巴细胞的灵敏度分别为1000和10000个细胞左右。 关键词：MTT；酶释放法；比色方法 中图分类号：R392.12 文献标识码：A MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- 文),其他试剂为本实验室配置。主要仪器用具：721分 zoliumbromide]是一种 四唑盐 ，经线粒体琥珀酸脱氢酶裂 光光度计(上仪三厂),酶免疫检测仪DG-3200,水平离心 解 后 生 成 Formazan,Formazan的生 成 量 与 细 胞 释 放 出 的 机，U型检测板及细胞培养器材等。 酶 活 性 成 比例 ，而 酶 活 力 与 细胞数及细胞 活力成 比例 。 实验方法：用MTT比色方法，细胞毒试验及细胞增 MTT酶 促 显 色 反 应 主 要 用 于 定 量 分 析 线 粒 体 琥 珀 酸 脱 殖实验，分析比较不同条件下MTT显色反应的性能特 氢 酶 反 应 ，在 细 胞 增 殖 、分 化 以及 与细胞生长代谢有 关 点。改变实验条件，分析影响实验结果的因素。 的 免 疫 学 实 验 中 有 非 常 广 泛 的应 用 [1～ 3]。该 方 法 自 2 检验结果与分析 2.1 Formazan溶解性能及其溶剂分析 Slater于 1963年 创 建 以 来 ，Baker(1979)[4],Nosmann 2.1.1 MTT和Formazan溶解性能及其光谱特性：MTT (1983)[5],Green(1984)[6]和Francois(1986)[7]等作过多次 是一种黄色粉状物，溶于水性溶剂，也溶于有机溶剂，但 改 进 ，90年 代 以后 ，为 了避 开Formazan在 水溶液 中难 溶 在有机溶剂中的溶解力低于水性溶剂，常温下需要较长 解 的问题 ，有人提 出用MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-z-y)-