人外周血染色体制备方法影响因素的分析.pdf

· 148· 中国优生与遗传杂志 2014年第 22卷第5期 人外周血染色体制备方法影响因素的分析 昌业伟’，李 风 ，唐 瑜’，马明仁’，贾庆华’，惠 玲’，哈小琴。 (1．兰州军区兰州总医院医学实验中心遗传室，甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，兰州 730050； 2．兰州解放军第一医院内分泌科，730050；3．兰州军区兰州总医院检验科，730050) 关键词：染色体；制备方法 中图分类号 ：R596．1 文献标识码 ：B 文章编号 ：1006—9534(2014)05—0148—02 人类细胞遗传学上多用人外周血淋巴细胞培养法制备 pH7．2～ 7．4条件下生长，低于pH6．8或高于pH7．6可能 染色体，但是各个实验室条件和个人操作手法及操作过程 对细胞有害，甚至退变或死亡。调节pH最常用的是NaHCO。 不尽相同，致使染色体标本制备的效果存在很大差异。本 溶液，此溶液可供cO，但c02易于逸出，因此适用于封闭 实验室对人体外周血染色体制各过程易出现的问题及实验 培养。 方法的影响因素进行总结，现把有效的避免方法介绍如下。 2 操作步骤 正常情况下，人外周血中没有中期分裂相细胞，只有 2．1 细胞接种 在异常情况下才能发现。外周血淋巴细胞一般情况下处于 接种血液时，血液量多少也会对染色体培养结果有一 增殖期中的GO (GI)期，未经培养的人外周血中很难找到 定影响。一般用7#针头加全血0．3～0．4ml即可。血液太 正在分裂的淋 巴细胞。植物血细胞凝集素 (PHA)是人类淋 少，细胞稀薄，会使细胞生长速度减慢 ；血液太多，会造 巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，能使处于G0期 成细胞生长时营养成份不够，影响细胞生存，导致收获不 的淋巴细胞转化为淋 巴母细胞，进行有丝分裂。利用PHA 到细胞或细胞状态很差 (染色体核型分散不好)。 这一特性，淋 巴细胞经过含有PHA培养液培养，在体外便 2．2 秋水仙素 可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，再用秋 秋水仙素在细胞培养分裂中所起作用是与微管形成或 水仙素处理，即可获得终止于分裂中期的淋巴细胞，进而 解聚密切相关的。秋水仙素一方面能阻滞微管 (纺纺锤丝) 得到所需的人体染色体核型。加之，淋巴细胞遍及全身， 形成，或使已形成的微管解聚，另一方面，秋水仙素的作 并在所有器官组织中不断循环，能反应个体整体水平情况 用又能促使DNA的复制和有关蛋白质合成 。可见秋水仙 而不象体细胞那样具有局限性。 素可抑制微管的合成使细胞处于分裂中期，又有生物毒性， 1 细胞培养 影响细胞生长。在常规染色体制备过程中，通常于培养 1．1 环境无污染 68～72h后加秋水仙素，使最终浓度为0．04～0．08~tg／ml 无菌操作和玻璃器皿的清洁要求比较严格，收获细胞 培养液，混匀后继续置 37C培养箱培养3～4h。我们的改 前的所有步骤都要保持无菌操作，防止细菌和病毒的污染， 进是于培养后68h加秋水仙素，使最终浓度为 0．8~tg／ml 无毒是培养细胞的必须条件，也是实验成功与否的关键。 培养液，混匀后继续置 37~C培养箱培养0．5h。一般秋水仙 体外培养的细胞由于缺乏机体的免疫系统等机制而失去对 素的浓度与处理时间有一定的关系，在秋水仙素浓度对染 微生物的防御能力，若发生细菌等微生物的污染，细胞最 色体有丝分裂阻断率的影响方面，陈德清教授等进行了大 后终至死亡。 量的工作 ，若秋水仙素浓度大，则处理时间短 ；秋水仙 1．2 温度的恒定 素浓度低，处理时间长。