伞形科常用中药品种rDNA序列特征及其标记方法研究.pdfVIP

维普资讯 · 鉴别 · 伞形科常用中药品种rDNA序列特征及其标记方法研究 赵国平。，钱三旗 ，新关稔 ，石川r~_z- (1．暨南大学医学院，广东广州510632；2．暨南大学生命科学学院，广东广州510632；3．日本弘前大学农 学生命科学部，青森036—8561) 摘要 目的：探讨伞形科27种常用中药指纹图谱鉴定的分子特征标记，探索筛选标记方法。方法：扩增伞形 科27种植物的rDNA序列，限制性 内切酶消化，聚丙烯电泳，其中6个品种测定rDNA序列。结果：PCR获得的rD— NA序列片段包括 ITS1、ITS2、5．8s全长序列以及 18S、26S部分序列。将PCR产物经限制性内切酶MSPI消化后的 电泳图，27个品种出现了16种特征性图谱 ，其中有 11个品种的图谱与其他品种不相同；经限制性内切酶HaeⅢ消 化后出现5种特征性图谱，其中有3个品种的图谱不与其他品种相同。6个品种经测序，获得了长度为652～656 bp的基因序列。根据rDNA序列构建的相似系统树，限制性内切酶消化电泳图相同的三组品种，序列相似度高。 结论：rDNA序列特征是伞形科中药鉴别的有效分子标记，序列测定法优于限制性内切酶切片长度多态性的分子标 记方法 。 关键词 中药；rDNA；标记方法 中图分类号：R282．71 文献标识码：A 文章编号：1001 54(2006)11—1148-06 生物类药材物种的多样性是 由基因的多态性决 用分子生物学手段进行中药鉴定具有重要意义。本 定的。核基因组的rRNA基因(rDNA)及其间隔区 课题采用 18—26SrDNA分子标记识别伞形科常用 ITS序列，近几年常用于中药品种的鉴定 以及被子 药用植物品种，研究其在中药品种鉴定中的价值。 植物系统与进化研究 。工]，被实践证 明是研究药材 1 材料与方法 道地性 、药用植物生态多样性十分有用的基因片段。 1．1 材料来源 用于DNA提取的材料为伞形科7 伞形科药用植物中有许多属于临床常用药，研究伞 属植物的新鲜或硅胶干燥的叶片。来源见表 1。 形科常用中药的分子特征标记及其标记方法，对于 1．2 总DNA提取 总DNA的提取方法为改 良的 表 1 DNA提取材料来源 基金项 目：国家 自然科学基金项 目(批准 · 1148· 中药材第29卷第 11期2006年 11月 维普资讯 CTAB法 (RogersBendich．1988)。 品正向、反向测序各2次，将 四次所测结果进行认真 1．3 引物设计与选择 rDNA的扩增引物根据 校对。 BungardNichdson1996 的论 文 设 计 J，rRNAf和 2 结果与讨论 rRNAr一对引物。rRNAf连接 18SrRNA基因3端上 2．1 rDNA序列片段 限制性酶切片长度多态性特 游26～30个碱基处，其序列为 5TGAAGTCGTAA． 征 经限制性内切酶MSP I和 Hae111完全消化后， CAAGGTTCCG3；rRNAr连接 26SrRNA基因5端下 聚丙烯电泳，EB染色，UV灯光下照相，形成了各 自 游30～33个碱基处，其序列为TCGCTFATFGATF． 的DNA标记的特征图。(见图1、图2) GATATGCTrAAACTCAG。 由图 1可以看 出，经 MSPI消化后 ，27种植物 1．4 rDNA 的扩增和纯化 rDNA采用 rRNAf+ 的rDNA获得了 16种具有特征性的图谱。其中重 rRNAr 进行整段扩增 。扩增程序为：94~C，3min； 齿当归、黑水当归、可食当归、北 白芷 、兴安 白芷