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实验一、 722型分光光度计的性能检定 一、实验目的 1．了解分光光度计的性能、技术指标和熟悉一般检查方法。 2．掌握分光光度计的正确使用方法。 二、实验原理 分光光度计利用色散元件（如光栅）和狭缝等组成单色器获得单色光，并使单色光通过有色溶液，再让透射光照到光电管上产生电流。由于溶液浓度不同，透射光的强度也不同，因此，可在仪器上读出吸光度或透光率。 仪器应具有足够稳定性、灵敏度和重现性。当溶液浓度改变时，测得值的改变 在一定范围内应符合Beer定律，具有较好的线性。因此仪器使用一段时间后，特别在更换光源灯时，一定要对仪器进行适当的检查。成套吸收池中各池的透光性能应相同。实验前，必须预习本讲义第二章§5紫外光度法和比色法技术（p32）。 三、实验步骤 (一)．波长精度检查 722型分光光度计波长精度为±2 nm 。 检查法：采用镨钕滤光片529nm特征吸收峰，通过逐点测试法来进行波长检查及校正（见注释）。 当要求不高时，可用580nm钠黄光作粗略检查。 (二)．吸光度精度检查（T~A转换） 仪器吸光度精度±0.004A（中性滤光片0.5A）。 检查法：选择开关置于“T”，调节透光率“ 100.0”后，再将选择开关置“A”，旋动“吸光度调零”旋钮，使得显示值为“.000”。 将0.5A左右的滤光片置于光路，波长500nm处（空气为空白），测得其吸光度A值。选择开关置“T”，测得其透光率，根据计算出其吸光度值。实测值与计算值两者允许误差为±0.004A。若两者误差较大则应进行校正，其方法见注释。 (三)． 线性误差检查 仪器的线性误差是以吸光度与溶液浓度的误差来衡量。线性误差应符合以下规定： 吸光度范围 允许线性误差 0.1～0.3 6％ 0.3～0.6 3％ 0.6～0.8 4％ 线性误差测定过程如下： 以H2O为空白，分别测量三种浓度的溶液的吸光度，测定波长为：440nm。读数三次（读到小数点后第三位）取平均值，将各次测得的吸光度记录于下表： 浓度 浓度C（g/ml） 吸光度（A） 第一次 第二次 第三次 平均值 （1）30 （2）33 （3）90 以（1）（2）（3）之A值计算440nm处仪器的线性误差。 A=KC（比尔定律） ，若符合线性， 有 由等比定律：, 此K是理想直线的斜率 求出、、浓度在理想直线上的吸光度,即： ，， 以为真值，计算各测量值的百分相对误差，即各点的线性误差： （四） 灵敏度检查 仪器的灵敏度是吸光度变化值与相应溶液浓度变化值之比。比值应符合以下规定： 灵敏度（△A/ΔC） 测定波长（nm） 0.012/3 440 检查法：用下表所列浓度溶液，在指定波长下，分别测定吸光度。 溶液浓度（g/ml） 测定波长（nm） 30与33 440 设每种溶液的两个浓度间的变化值为C，测得相应吸光度的变化值A。则 灵敏度=A／C 将计算的灵敏度与上述规定比较，判断仪器灵敏度是否符合要求。 （五） 重现性检查 仪器在同一工作条件下，用同一种溶液连续重复测定7次，其透光率最大读数与最小读数之差，不应大于0.5％。 四、注意事项 1．必须预习§5和本实验附1（或附2），否则影响实验效率。 2．检查所用成套比色皿。透光率相互差值不大于0.5％，否则测得吸光度应作校正。 1．同组比色皿透光性差异对比色有何影响？ 2．检查分光光度计的波长精度和灵敏度，各有什么实际意义? 紫外可见分光光度法操作技术 一、分光光度法：通过测定被测物质对特定波长或一定波长范围电磁辐射的吸收，对该物质进行定性、定量分析的方法。 二、基本原理： 紫外线照射---价电子跃迁---紫外可见吸收光谱 透光度transmittance (T) T=I/I0 吸光度 absorbance （A）beer 定律 A=ECL 摩尔吸光系数（ε） 百分吸光系数（E） 吸光度的测定 (1) 吸收池要配对