pSURE-T simple 载体连接试剂盒.pdfVIP

◆ pSURE -T Simple 载体连接试剂盒 ◆ 目录号 1702 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 pSURE- T Simple 载体连接试剂盒 目录号：1702  试剂盒组成、储存、稳定性： 20 次 60 次 20 次 60 次 组成 ( 170201) ( 170202) ( 170203) ( 170204) p SURE-T Simple vector （30ng/l） 20 l 60l 20 l 60l 1000bp Control （30ng/l ） 5l 5l 5l 5l 10 PEG Enhancer 50l 150l 50l 150l 2 Quick Ligation Buffer 100l 300l 10 x Ligation Buffer 40l 120l T4 DNA ligase, 5U/l 100U 300U 储存：－20℃ 保存，载体反复冻融至少10 次不影响使用质量。  产品介绍： pSURE-T Simple Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。这种 载体是由pUC19载体改建而成，和传统T载体ECOR V切开后加T方法不同，pSURE-T Simple 通过改造pUC19 ，在原pUC19 多克隆位点引入 Xcm I酶切后使其原多克隆位点 两侧的3 ’末端直接产生未配对的T碱基，因此有更高的重组效率。同时它消除了p UC19 载体上的多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要 在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进 行DNA酶切时，酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可 以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。这种载体尽管消除了LacZ基因上的多克隆 酶切位点，但不影响b-半乳糖苷酶的正常表达，因此，PCR产物克隆后仍可以利用a- 互补性进行蓝白菌落的筛选， 挑选阳性克隆。由于这种载体是以pUC19载体为基础构 建而成，所以它们具有同pUC19载体相同的功能。可以用M13通用引物进行测序（不可 用T7通用引物测序，因为T7 已经消除了）。 - 1 - 本说明书末列出了pSURE-T Simple 载体相关的技术资料，其全序列可参照pUC19 （GenBank Accession Number M77789 ），只是其多克隆位点部分的序列有所不同。  操作步骤： 1. 连接反应的准备： PCR产物是否要进行纯化取决于扩增产物的质量。如果PCR产物非常干净，不经纯 化就可直接进行连接反应。但如果是以质粒为模板的PCR产物则必须进行纯化，模 板质粒有可能也形成白斑。PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。本公司生产的 DNA产物快速纯化回收试剂盒对70bp 以上的DNA片段能很好地进行回收。 Taq、Tth、AmpliTaq 、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其末端都带有一个突 出的3’ A 。Taq酶和Pfu 、Pwo 、Tli或Deep vent 等具有35 ’外切酶活性的DNA 聚合酶混合扩增的产物末端可能带有3’ A 。具有3’ A末端的PCR产物可以直接用 pSURE-T 进行克隆连接。具有3’5 ’外切酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物是 平末端，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先进行3’端加A工作。 2. 常规连接反应： 1). 在标准的10 l 连接反应体系中，加入1 l 30ng pSURE-T Simple 载体、X l PCR 产物(在通常状况下，没有必要对PCR 产物进行精