新课题1DNA的粗提取与鉴定.ppt

* 课题 1 DNA的粗提取与鉴定 染色体成分 蛋白质 DNA 1、提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2、生物大分子 主要指蛋白质、酶和核酸 3、提取DNA的基本思路 利用DNA与 等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分 提取DNA的方法 RNA、蛋白质和脂质 4、原理（1）分离---DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反 ①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？ 在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。 ②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？ 当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出 4、原理 （2）提纯---DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离 （2）提纯---DNA对酶、高温和洗 涤剂的耐受性 ①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响 ②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性 ③洗涤剂能够瓦解细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响 5、DNA的鉴定 （1）DNA与二苯胺（沸水浴)反应呈现蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 （2）甲基绿（蓝绿色） （一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 鸡血细胞与外界溶液相当于一个渗透系统， 在蒸馏水中会发生渗透吸水，使细胞涨破。 制鸡血细胞液 0.1g/mL柠檬酸钠100mL 活鸡鲜血180mL 500mL烧杯中，玻棒搅拌，离心或静置沉淀。 离心或静置后去掉上清液 血浆 血细胞 2、植物细胞 ①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜 ②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的 和 ，进行充分的 ，过滤后收集研磨液 洗涤剂 食盐 搅拌和研磨 讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ （三）去除滤液中的杂质 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质 （四） DNA的析出与鉴定 （四） DNA的析出与鉴定 鉴定 不变蓝 —— 对照组 溶液逐渐 变蓝 丝状物 (DNA) 实验组 图示 结果 加入物质 比较 均加入： ①4 mL二苯胺试剂 ②2mol/LNaCl溶液5 mL 鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。 自变量 你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？ 洋葱的鳞片叶表皮细胞 取少许丝状物，置玻片中央， 加1滴甲基绿溶液，丝状物变成绿色。 鉴定所用的试剂是二苯胺或甲基绿。 用二苯胺须加热。用甲基绿不用水浴加热。 1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得） 0.1g/mL柠檬酸钠100mL 活鸡鲜血180mL 500mL烧杯中，玻棒搅拌，离心、分离或静置沉淀。 2.提取DNA。 ①取血细胞5-10mL＋20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌。 ②纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。 ⑴.提取血细胞核物质： ⑵.溶解核内的DNA： 滤液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓搅拌。 实验步骤 ⑶.析出含DNA的粘稠物： ⑷.滤取含DNA的粘稠物： ⑸. DNA粘稠物的再溶解： 在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L）。 用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。 20mL2mol/L的NaCl溶液 步骤⑷含DNA的粘稠物 在20mL烧杯中轻缓搅拌3min，使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液。 ⑹.过滤含有DNA的NaCl溶液： 用放有两层纱布的漏斗过滤步骤⑸所得的溶液，滤液中含有DNA。 ⑺.提取含有杂质较少的DNA： 步骤⑹所得的滤液＋体积分数为95%的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，