色谱分析法3.ppt

4、检测器 作用—— 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等 （1）紫外-可见检测器 （2）荧光检测器 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2?3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。 荧光检测器结构示意图 （3）蒸发光散射检测器 蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。 （4）电化学检测器（以电导检测器为例） （5）示差折光检测器 浓度型监测器，适当条件下对所有的溶质都有响应，应用范围宽 液相色谱分离模式 一、吸附色谱（adsorption chromatography） 原理： 基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。 固定相： 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。 吸附色谱 1. 流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等 2. 流动相的选择原则是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。 为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很广则使用梯度洗脱 应用 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象 二、液液分配色谱 原理： 主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式 液液分配色谱 液-液分配色谱固定相是通过物理吸附的方法将固定液涂在载体表面，由于流动相的溶解作用或机械力作用，固定相容易流失，导致保留行为的改变，重现性很差，引起分离试样的污染 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去 键合固定相 最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶 ，优点是： ①硅胶的强度大； ②微粒硅胶的孔结构和表面积易人为控制 ③化学稳定性好 最常用的键合相键型是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物 ； 最常用的“万能柱” ——“C18柱”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。在反相色谱中发挥着极为重要的作用，可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。 C18有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，在生物化学分析工作中应用最为广泛。 按键合到载体上的官能团可分为： 非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱、C8、C4等 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子 液液分配色谱类型 正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC，适合于分离极性化合物 反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物 液液分配色谱流动相的选择原则 ①样品易溶，且溶解度尽可能大 ②化学性质稳定，不损坏柱子 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收 ④粘度低，流动性好 ⑤易于从其中回收样品 ⑥无毒或低毒，易于操作 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯 ⑧废液易处理，不污染环境 正相色谱 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇 其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80％的顺、反 和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离 在正相色谱柱中，极性弱的先流出 反相色谱 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，