胃内的分泌蛋白影响骨质代谢的相关机制研究--《南方医科大学》2009年博士论文.docVIP

胃内的分泌蛋白影响骨质代谢的相关机制研究--《南方医科大学》2009年博士论文 研究背景 随着社会的老龄化,骨质疏松症(osteoporosis,OP)的发生日渐增多,但OP的发病机理至今尚未被人们完全认识,能够导致OP的相关因素有很多,这包括:遗传因素、女性绝经、钙离子摄入或吸收的不足等等。近年,由于患消化道疾病而引发OP的现象逐渐引起了人们的重视。许多患胃肠道疾病的患者,尤其是经过全胃或部分胃切除的患者会发生明显的全身骨量减少的现象。进一步的实验及临床对照研究均证实消化道疾病与OP的发生关系密切。对其原因的认识最初认为是由于胃切除后胃酸减少而引起钙吸收不足,然而实际上并非如此简单。目前大量研究结果显示:胃粘膜所分泌的某种成份可以增加实验动物的骨量,而且其分泌受胃泌素(gastrin)的调控;经肽链端解酶酶解后这种促进成骨的作用消失。学者们由此推测出:胃粘膜中的分泌细胞可以分泌一种具有促进骨合成作用的激素肽,并将其命名为胃钙素(gastrocalcin),并把它认为是继甲状旁腺激素、雌激素、维生素D之后的第四种骨钙调解激素。 目前针对骨质疏松症的药物干预主要包括两方面:骨吸收抑制剂和骨和成促进剂。骨吸收抑制剂包括:雌激素、降钙素、双磷酸盐等。这些药物可以通过抑制破骨细胞的骨吸收功能减少骨量的损失,从而暂时防治骨质疏松症,但是由于骨的更新转化受抑制将导致骨质的老化、陈旧。因此治疗骨质疏松症不仅需要应用骨吸收抑制剂来防止骨量持续降低,而且还需同时使用刺激骨形成的药物以增加骨量,可采用联合用药。骨吸收抑制剂只能维持骨量和暂时骨形成增加,应用骨形成促进剂才会有效地提高骨量,这也是当前世界治疗骨质疏松症新药研究的主要方向。目前,骨形成刺激剂主要为甲状旁腺激素,已于2002年由美国FDA批准用于骨质疏松症治疗。但已有的PTH制剂价格昂贵,需注射给药,限制了其推广应用;而且有研究认为PTH的正性作用仅限于脊柱,其他部位可能均为负性效应,对骨折风险的影响尚待进一步研究。 总之,针对与胃粘膜中存在的这种促进骨合成活性物质的研究及应用有着广阔的研究、开发前景。然而到目前为止,这种从功能表现方面推测出的胃钙素到底是什么蛋白,仍旧未知。其性质不明则难以针对其进一步研究,难以阐明胃切除或病变诱发骨质疏松症的作用机制,也就无从采取基于此方面的各种具有针对性的干预措施。因此本课题为试图阐明胃钙素的性质,展开了一系列探索性研究。 研究目的: 1.观察胃粘膜提取物对成骨细胞生物学活性的作用。因为成骨细胞是机体骨质形成的执行者,以往的研究虽然已确定了胃粘膜提取物中含有促进机体骨量增加的因子,但是其对成骨细胞生物学活性的影响尚无研究,所以我们首先要明确胃粘膜提取物是否对成骨细胞的成骨活性有影响,有何影响。 2.对胃钙素候选蛋白进行筛选,从而确定胃钙素的性质。根据胃粘膜中促进骨形成因子可受胃泌素调控,即胃泌素可以促进这种因子释放的特点,我们采用了蛋白质组学技术,对受胃泌素干预前后,胃粘膜中所差异表达的蛋白进行筛选,试图从这些差异表达的蛋白中找到这种促进骨形成因子——即胃钙素。 研究意义: 1.观察胃粘膜提取物对成骨细胞生物学活性的作用将阐明其促进成骨的作用机制。 2.筛选出胃钙素并确定其性质,将有利于阐明胃切除或病变诱发骨代谢疾病的机制,有助于加深对骨代谢和OP的病理机制的认识;为防治OP提供新的干预靶点。 拟解决的科学问题 1.胃泌酸粘膜提取物是否直接通过成骨细胞来实现促进成骨的作用? 2.胃泌素干预后胃粘膜组织中所表达的差异蛋白有哪些? 3.胃泌酸粘膜提取物中这种促进骨合成因子——即胃钙素究竟是什么? 研究方法: 1.采用多次酶消化法,体外分离培养大鼠幼鼠的成骨细胞,利用细胞形态学观察、Giemsa染色、碱性磷酸酶染色、钙结节染色、荧光染色等方法对成骨细胞进行鉴定。 2.大鼠胃粘膜组织蛋白的制备。取大鼠胃囊,剥离下胃粘膜组织置于匀浆缓冲液中进行匀浆。离心、弃沉淀,上清液通过一系列空隙从大到小的微孔滤膜进行过滤。滤液离心、弃上清,沉淀溶于盐水中,超声冰上震荡,滤菌、测浓度后以生理盐水将其稀释为低(10~(-3)g/l)、中(10~(-2)g/l)、高(10~(-1)g/l)三种浓度,-80℃保存。 3.激光共聚焦显微镜观察。成骨细胞接种于激光共聚焦显微镜专用皿中,细胞贴壁后继续培养24小时后行细胞内钙离子的荧光标记。将培养皿置于激光共聚焦显微镜的载物台上,观察施加不同浓度胃粘膜提取物刺激前后细胞内荧光强度的变化,获得反映细胞内钙离子浓度动态变化的曲线。 4.成骨细胞的增殖观察。细胞接种于96孔培养板,每孔接种2000个细胞,过夜细胞贴壁后,每孔分别加入不同浓度的胃粘膜提取物或以生理盐水作为对照来干预细胞,按照CCK-8试剂