黑曲霉发酵生产柠檬酸.doc

黑曲霉发酵生产柠檬酸 柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid）。商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C6H807·H2O,相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C6H8O7，相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger）、文氏曲霉(Asp.Wentii)和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。 5.3.1 柠檬酸发酵 实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。 2、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为: 柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 3、实验装置材料与流程 实验装置与材料 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min）。 菌种 黑曲霉（Asp.niger）柠檬酸生产菌株Co8-27。 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。 器皿 15mL试管、100mL三角瓶、2000mL烧杯、500mL三角瓶、离心管若干。 试剂 0.1429mol/L NaOH、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。 试剂 0.1429mol/L NaOH、1%酚酞试剂、斐林甲和乙溶液、0,01%标准葡萄糖溶液、淀粉酶（中温酶和高温酶） 实验流程 保藏菌株→ 活化菌株（斜面培养）→ 200mL三角瓶麸曲培养→500~1000mL三角瓶液体发酵。 （4）斜面培养基: 马铃薯琼脂培养基 去皮马铃薯200g切成小块，加水约500mL，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g，琼脂20g，溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121℃灭菌20min，取出摆成斜面备用。 麦芽汁琼脂培养基 2/3大麦芽加1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉:水＝1:4比例加水，置60℃下糖化4h至碘液显示无色，然后离心15min，获得麦芽汁（或取啤酒厂未加酒花的麦芽汁）调整浓度50Brix，添加25g/L琼脂，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。于121℃灭菌15~20min，取出摆成斜面备用。 ③ 一级种子（麸曲种子）培养基 含麸皮的查氏培养基（g/L）：蔗糖 30；KNO3 1.0；K2HPO4 1.0；MgSO4·7H2O 0.5；KCI 0.5；FeSO4·7H2O 0.01；调节pH7.0~7.2，加水定容至1000mL，添加800g麸皮，拌匀至无干粉又无结团，分装入8~10个500mL三角瓶中,塞入8层纱布并包扎好。于121℃下灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。 麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目