氨基树脂固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究.pdfVIP

亿 亏 与生 物 互程 2014，Vo1．31No．09 囡 Chemistry Bioengineering doi：10．3969／j．issn．1672—5425．2014．09．005 氨基树脂 固定化 S一腺苷 甲硫氨酸合成酶的研究 尹春丽 。曹珊珊 。许 乐 ，陶贵荣 。牛卫宁。 (1．西安文理学院生命科学系，陕西 西安 710065；2．西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072) 摘 要 ：以氨基树脂为载体对 S一腺苷 甲硫氨酸 (SAM)合成酶进行 固定化 。优化 了酶的固定化条件并对 固定化酶 的 性质进行 了研究。优化的固定化条件为 ：戊二醛体积分数 5 、SAM 合成酶添加量 20mg ·g～ 、固定化 时间 5h。所制 备的 固定化 SAM 合成酶 的酶 活力为 476．8U ·g～ ，酶活力 回收率为 74．5％。与游 离SAM 合 成酶相 比，固定化 SAM 舍成酶的稳定性大幅提高，在 5O℃孵育 5h酶活力仍保 留 61．2 ，而游离SAM 合成酶则完全失活；在 pH值为 6．0～ 6．5、8．0～9．5的缓冲溶液 中，固定化 SAM 合成酶也更加稳定 ；固定化 SAM 合成酶连续催化反应 10批次，酶活力保 留 86．3 ；固定化 SAM合成酶在 4℃储存 30d，酶活力保留81．4％。固定化 SAM合成酶米 氏常数 K =0．14mmol· L_。，K =0．28mmol·L_。。 关键词 ：S一腺苷 甲硫氨酸合成酶 ；氨基树脂 ；固定化酶；酶学性质 中图分类号 ：Q814．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1672—5425(2Ol4)o9—0017-04 S一腺苷 甲硫氨酸 (S—adenosylmethionine，SAM)作 的性质进行了研究 ，以期开发适用于工业化应用的固 为药品和保健品已得到广泛应用[1屯]，其制备方法主要 定化酶 ，为酶法工业化生产 SAM 奠定基础 。 有酵母菌发酵法和体外酶促转化法。与酵母菌发酵法 1 实验 相 比，体外酶促转化法合成 SAM 具有生产周期短 、底 物转化率高、纯化工艺简单以及环境友好等优点，具有 1．1 菌种、材料与试剂 良好的工业化应用前景[=I]。目前，体外酶促转化法合 重组大肠杆菌 E．coliJM109(pBR322一SAMS)， 成 SAM 需要解决的关键 问题是大量廉价 SAM合成 本研究室构建ul4]。 酶的获得以及选择合适的载体 固定化 SAM 合成酶 ， 苯基琼脂糖凝胶预装柱 (Phenyl—SepharoseFast 以大幅提高固定化酶的稳定性和重复使用批次。 Flow)，美国 GE公 司；SepliteLX一1000HA 型氨基 树 作者在前期研究 中构建了组成型表达 SAM 合成 脂，西安蓝晓科技有限公司。 酶的重组大肠杆菌[4]，并对 SAM 合成酶进行 了固定 S一腺苷 甲硫氨酸 (SAM)标准 品，美 国Sigma公 化研究 。结果表明，通过海藻酸钙包埋法和壳聚糖一戊 司；其余试剂均为分析纯 。 二醛交联法得到的固定化酶 的机械强度较低，重复使 1．2 SAM 合成酶液的制备 用过程中容易破碎[5。]。而 Luo等[8使用镍离子亲和 SAM合成酶的表达和纯化参照文献[11]进行，步 层析介质固定的酿酒酵母 SAM合成酶也存在酶活力 骤如下 ： 回收率低以及固定化酶重复使用批次少等不足。 大肠杆菌 E．coliJM109(pBR322一SAMS)在含有 氨基树脂作为一种人工合成 的多聚物 ，具有机械 15 g·mL 四环素的LB培养基中30℃过夜培养至 强度高、酶载量大等优点，已经被广泛用作固定化酶载