Salsolinol合成酶的粗提取和其活性检测.pdfVIP

第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 P．G012 Salsolinol合成酶的粗提取及其活性检测· 陈薛钗，林汉斌，从珍珍，邓玉林¨ 北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081 Salsolinol合成酶是一种催化多巴胺(DA)和乙醛生成Salsolinol的酶11J，它是脑内合成Salsolinol 及其衍生物的关键酶，也是儿茶酚异喹啉类物质导致细胞毒性显著增加的有效激活因子，它分布于 各个脑区，但主要分布于黑质．纹状体区域，它在整个代谢过程中起决定性作用，因此它可能是帕金 森病(PD)的一种关键致病因子【2】，其深入研究将有助于为PD致病机理和治疗的深入研究提供有力依 方法检测其各个脑区的酶活，为该酶的进一步分离纯化及性能表征提供基础。 关键词：Salsolinol，合成酶，多巴胺，活性检测 1 实验部分 1．1酶粗提取 mM 正常SD大鼠(200-J：209)灌流取脑，剥离脑灰质区、纹状体、黑质和小脑，分别悬浮于100 Tris—HCI(pH 取上清液得到粗酶提取液，置于．80℃保存。 1．2酶反应条件 mM 酶样品分别置于100 Tris-HCI(pH7．4)中，加入底物：lmMDA和lmM乙醛【5】，37C水浴 30min，PCA终止反应，170009离心10min，4C，0．22IJtm滤膜过滤。 1．3HPLC．ECD条件 ‘器、ESAModel 6210四通道电极、5600A型库仑阵列检测器(ECD)及配套色谱工作站。固定相： 反相C18柱(4．6(i．d．)×150 柠檬酸、20mmol／L磷酸氢二钠、0．3mmol／L 柱温：30℃：进样量：40儿。 2结果与讨论 2．1Salsolinol合成酶的存在 Salsolinol，同时为排除其他因素带来的干扰，我们设置了五组不同的空白对照，如图l所示。结果 显示，阳性反应组的产物Salsolinol生成量，显著高于单底物对照组及酶灭活组的产物生成量。由此 本结果与文献报道相吻合。 ’国家自然科学基金(No资助项目 “通讯联系人，邓玉林，电话：010Email：deng@bit．edu．∞ 里±主堑全国堡堕芏查塑堂皇墨丛墨垦些垒垒丛堡塞墨 2．2Salsolinol台成酶的分布 为了考察Satsolinot台成酶在脑中不同区域的分布情况．我们分别检测了鼠脑中灰质、纹状体、 黑质、小脑等区域的活性。如图2显示．该酶活性在各个区域中均有分布．只是在黑质-纹状体医活 性高于其他部位．选可能与该区域的DA分布较多有关。黑质活性高导致DA生成减少．DA通过黑 质-纹状体系统的量减少．从而具有诱发PD的潜能。该酶正常情况下是满在的，只有在底物浓度较 高时才会被大量激活．有活性的酶使DA代谢成Sal，这也许能解释PD病变在于脑中的黑质及其上 行的黑质纹状体通路的原因。由此推铡．SaLsolinol台成群可能艟PD的一种致病辨于，有待进一步 研究。 k▲．． ．j趣1 ； b．．I▲ ▲ 。 }∞I-Ⅵ ’．I▲ ． ． L ■ ． 一{一ME2-∞若 l… I▲ ． 一 I ，‘ }W}．_ 哺I■ 罔I*旧空自对月 I 活) 阳性组足DA+Ach+算辑 融2 ， 1{ 图 惑 弘i 获质 纹状体 黑质 小脑 圈2鼠齄不闻区域中Salsolinol合成醇话蛀的分布情况 3结论 本文初步建立了鼠脑中Salsolinol合成酶提取及活性检测的方法，并在不同的脑区均