鸡IL-1β与IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立.pdfVIP

四川省畜牧兽医学会2010年学术年会 鸡IL一1 IL一2及IL一6基因实时荧光定量 13禾n RT—PCR检测方法的建立冰 曾 李洁萍1 刘丽达h3倪学勤1工 东-．2魏豪1 (1．IⅡlJ{I农业大学动物医学院动物微生态研究中心；2．动物疫病与人类健康I四)ll省重点实验室四川，雅安625014； 3．四川省疾病控制中心四JlI，成都610000) Green I染料法，以常规PCR产物为标准品，建立标准曲线，并进行熔解曲线分析。结果表明，各基因标准 曲线Ct值检测范围在12—33左右。有良好的线性关系，r2均大于0．990。熔解曲线分析表明，产物为特异的 期短，为从mRNA水平对鸡IL进行定量分析奠定了基础。 关键词IL—lB、IL一2、IL一6；实时荧光定量PCR；鸡 机体免疫调节，在一定程度上反应了机体的免疫功能。IL与其他免疫系统，通过作用于T细胞、B细胞及 自然杀伤细胞(NK)等多种靶细胞来传递免疫信息，激活、调控血细胞的生长发育与分化成熟，参与机体 的免疫应答，同时也参与某些疾病的病理过程。 IL的表达水平是机体免疫力的指示器，通过检测机体IL的丰度，可以对机体免疫系统的活化程度进 行初步评价，了解疾病的发病机制。国外对鸡白介素等细胞因子表达研究的报道较多，尤其是鸡IL—lp， 疫增强作用中的联系。而国内对鸡白介素的检测主要是通过免疫学方法和ELISA，在蛋白质水平测定其 在外周血清中的含量。与传统免疫学方法和ELISA相比，实时荧光定量PCR技术是从mRNA水平直接探 测PCR过程中的荧光变化，所需模板较少，灵敏度更高，准确、快速。目前国内采用实时荧光定量PCR对 人员科研启动基金 Ce-．,-蕾简介：刘丽达(1985一)．女，四川乐山人，硕士研究生，主要从事动物微生态学研究．1iulidal985@yahoo．con．cn 通讯作者：倪学勤，教授，xueqinni@yahoo．corn 已发表：《中国兽医科学}2009．39(12)：11(灿1108 290 第三篇疾病防治 鸡IL表达量研究的报道不多，该方面方法建立的报道更为少见，本研究旨在建立一种可快速检测鸡IL-l Green I实时荧光定量PCR方法，为鸡细胞因子的研究提供基础。 p，IL一2，lL．6基因mRNA的SYBR 1材料与方法 1．1材料 1．1．1 实验动物6周龄健康肉鸡，购置于雅安天全某鸡场。 PCR仪(Bio—Rad 1．1．2主要仪器iQ5荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司美国)，MyCycler“ThermalCycler 公司美国)，凝胶成像系统(Bio—Rad公司美国)，高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司湖南)等。 ReverTra Aca组合型试剂盒(成 1．1．3主要试剂UNlQ一10柱式总RNA抽提试剂盒(上海生工)，RT—PCR Ex II(PerfectReal PCRKit(jt京天恩泽基因 都博瑞克)，SYBR@Premix Time)(大连宝生物)，Instant TaqTM 科技)等。 1．2引物设计合成 表l。 表1鸡IL-18，IL-2，IL_6，GAPDH和B—actin实时荧光定量PCR扩增引物的序列 1．3 方法 1．3．1 RNA提取与反转录取健康肉鸡小肠肠段，用生理盐水冲洗后，在研钵中加入液氮研磨。采用 ReverTra Aca组合型试剂盒说明进行反转录。反转录的cDNA一20℃保存备用。 L：0．5uL