2013年必威体育精装版高中生物精品教学课件：血红蛋白的提取和分离(5)(人教版选修1).ppt

本课题学习目标 本课题学习重点和难点 采集得到血液 柜式离心机 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 磁力搅拌器 搅拌器转子 搅拌器正在工作 利用透析袋透析 装配好的凝胶柱 开始进行层析 收集得到的纯化后的蛋白 教学反馈 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度 3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白 5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物 2.凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 （2）凝胶色谱柱的装填 50cm高 （3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 （3）样品加入与洗脱 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 思考下面的问题： 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观