DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验.docVIP

Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳 Aptamer识别肿瘤细胞 若选择4℃识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37℃就不用控温了。 Aptamer浓度：荧光标记的是50μM，没有标记的是100μM DNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。 1. 取7.3μl aptamer（100μM）于1460μl小鼠血清（无需过滤）中，在37℃细胞培养箱中孵育； 2. 于不同时间点（6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min）取200μl该小鼠血清到新的EP管中，加入200μl（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊； 3. 用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层； 4. 取上清到新的EP管中。在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200μlTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）； 5. 用15000转/分离心10分钟，收集上清； 6. 重复4、5步直到上清澄清； 7. 在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中； 8. 加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）； 9. 重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发； 10. 加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃冰箱中30分钟（DNA沉淀）； 11. 用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟； 12. 将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。原管中保留约30μl溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。） 13. 在管中加入16μL 1*TE溶液； 14. 进行电泳分析前，将样品在95℃水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链），上样或保存在-20℃冰箱中。 聚丙烯酰胺凝胶电泳------注意实验中戴好手套！！！ 准备：清洗干净玻璃板、凉干！装好电泳的玻璃板（用1.5mm的厚玻璃板）；有凹槽的一面向内！！压紧，避免漏液！ 2. 配胶： 20%变性聚丙烯酰胺凝胶8ml：称取尿素3.36g，加入45%丙烯酰胺溶液3.56ml，5×TBE 1.6ml，加热使尿素溶解（可用55℃水浴加热），通过10ml量筒加水至8ml，轻混匀后放在冰上冷却（溶液温度较高时，加入催化剂后将迅速凝胶，甚至来不及灌胶），加入3-6μlTEMED（助催化剂）、10%过硫酸铵60μl（催化剂）。催化剂过多可能导致来不及灌胶就凝胶！！ 3. 灌胶：加入TEMED和过硫酸铵后，用tip头轻搅混匀，迅速灌胶；灌胶应当一次性、顺畅地完成，避免形成断层！插上梳子，约30分钟成胶（观察梳孔间的凝胶情况）； 4. 垂直小心地拔出梳子，小心产生气泡；拿掉玻璃板底下的防漏胶带！重新装好玻璃板！注意有凹槽的一面向内！！ 5. 用超纯水、1×TBE溶液冲洗加样孔（很重要，若没有清洗干净，将影响电泳）；加满整个梳孔后用滤纸吸干即可。 6.将电泳槽及电泳装置灌满1*TBE缓冲液（盖过凝胶）