磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA的研究及其在诊断试剂中应用.pdfVIP

磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA的研究 及其在诊断试剂中的应用 陆佳飞1、周克隆2、王缦2 l、华东理工大学生物工程学院生物化学与分子生物学，上海，200237 2、上海科华生物工程股份有限公司，上海，200233 摘要 目的建立一种基于磁珠法的快捷、简便、高纯度的血液病毒核酸的提取方法。使之在 充分保留了现有煮沸法便捷特性的情况下，增强其抗干扰性能力，为核酸定量检测的全自动化提供 有效支撑。方法以乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的提取为例，研制出一套快速的、适用于临床诊断 的磁珠抽提方法。通过平行检测100例临床血清样本及梯度稀释的阳性样本，从定量线性范围、灵敏 度、特异性、精密度等方面与已在临床广泛应用的、成熟的煮沸法进行相关性分析；并用肝素钠、乳 糜、EDTA对两种方法进行抑制物干扰实验和线性分析。结果磁珠法在精密度、灵敏度、特异性等 方面都优于煮沸法，但两种方法在常规标本的检测中无显著的差异；在抑制物方面，当肝素钠浓度 达到62．5U／ml后，对煮沸法提取的高低浓度的HBVoDNA阳性样本有明显的抑制作用，而磁珠法并不 显著；血脂对两种方法提取的HBV-DNA含量干扰不明显，EDTA对高浓度的阳性标本有很明显的抑 制作用。结论采用以磁珠法为基础的核酸提取方法，核酸得率高，具有较宽的检测范围和定量准确 性，操作简单，可做为实验室首选的核酸提取方法，并可应用于临床诊断。 PCR 关键词磁珠法煮沸法HBV-DNA 的方法，运用于核酸临床诊断的核酸提取，力争打破 乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)是反映乙肝病毒复 制直接、可靠的实验指标。目前国内检测HBV-DNA，国外同类产品的技术垄断。 较多采用构建在TaqMan技术上的实时荧光定量聚合酶 一、材料与方法 链反应(FQ．PCR)，该法灵敏、快速、特异性强。HBV- DNA定量检测因而成为临床诊断HBV感染以及判别抗 1．1标本的来源 病毒治疗疗效等方面的重要参考指标【l司。但FQ．PCR的 按卫生部临床检测相关要求进行样本采集。用无 实验要求较高，样本处理以提取核酸作扩增反应模板 菌注射器抽取受检者静脉血，注入无菌采血管或离心 是一重要前期步骤，不同处理方法可直接影响PCR扩 管中，室温或2～8℃静置24,时后，常规离心获取上 增效果与实验检测结果p】。因此如何快速、简单、高效 清，转移100--一500lal上清至无菌1．5ml离心管中，即为 提取血清中HBV-DNA就显得很重要。 血清样本。经抗凝处理的血液，离心后的上清即为血 磁珠法提取DNA适用范围广，可以用于血斑、 浆样本。抗凝剂可采用EDTA、柠檬酸钠等，避免使用 唾液斑、汗斑等大多数生物样本的提取，操作方法简 肝素类抗凝剂。待测样本保存于．20℃(长期)，避免反 单，不需要特殊的分离设备，避免了反复离心而造成 复冻融。乙型肝炎l临床强阳性血清样本，经乙型肝炎 的DNA损失。近年来，国外的各大生物技术公司相 (HBV)病毒核酸国家标准品(购自中国药品生物制品检 IU／ml。 定所)定值，确定浓度为4．00E+08 继推出自己的磁珠试剂盒，如Promega公司的DNA—IQ DNA试剂盒等用于 1．2试剂 试剂盒、Qiagen公司的Magattract 生物样本中DNA的提取。而我国磁珠提纯核酸以及核 乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测 酸自动化提取方面的研究才处于起步阶段。由于国外 试剂盒(煮沸法)和HBV工作标准品由上海科华生物 试