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人白细胞蛋白质双向电泳图谱分析.doc
人白细胞蛋白质双向电泳图谱分析
陈小青,马中春,龙再浩,虞维娜
(中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 浙江 宁波 315012)
【摘要】 目的:建立人白细胞蛋白质提取及双向电泳分析方法, 为构建白细胞在不同生理或病理条件下的蛋白质表达谱或进行蛋白质表达的差异分析奠定基础。方法: 取人全血, 分离白细胞,提取蛋白质,双向电泳分离,银染染色获得蛋白质的电泳分离图谱,利用Image Master 2D分析软件进行图像分析。结果: 所得双向电泳图谱中各点分离清晰, 无明显横向或纵向拖尾,分析显示图谱上有230个蛋白质斑点, 主要集中在p H 4. 5~6.8 1 之间, 其中高丰度蛋白斑点有22个点,低丰度的蛋白质斑点约208个。结论:本实验建立了人白细胞蛋白质的双向电泳分析方法, 图谱分离、染色效果好,能满足2-DE专业软件分析的要求,为后续白细胞的蛋白质组研究奠定了基础。
【关键词】 白细胞; 双向电泳; 蛋白质组
蛋白质组( proteome ) 是指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。这一概念是由澳大利亚学者 Wilkins和 Williams于 1994年提出。 并最早见于 1995年7月的“Electrophoresis” 杂志上【1】。蛋白质组学( proteomics ) 是以蛋白质组为研究对象, 是在蛋白质多肽谱和基因产物图谱技术的基础上发展而来的, 是在动态水平上通过对蛋白质进行测定, 来阐述环境、 疾病、 药物等对细胞代谢的影响, 并分析其主要作用机理, 解释基因表达的主要形式。而双向电泳技术 ( Two—dimensional el ectrophoresis, 2-DE ) 是蛋白质组学研究中的关键技术,目前已经广泛应用于多种正常和肿瘤组织蛋白质图谱的建立和特异性标志物的筛选研究。白细胞( 包括中性粒细胞、 酸性粒细胞、 碱性粒细胞、 单核细胞和淋巴细胞) 作为机体的特异性、 非特异性免疫反应以及变态反应的主要细胞, 关于它的基础和临床方面的研究很多, 但对其进行蛋白质组方面的研究工作尚未见公开报道, 本研究建立了人白细胞蛋白质提取及双向电泳的方法, 为构建白细胞在不同生理或病理条件下的蛋白质表达谱或进行蛋白质表达的差异分析奠定基础。
1 实验材料
1.1 试剂
丙烯酰胺、 N, N一甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠( SDS) 、 二硫苏糖醇 ( DTT) 、过硫酸铵、 CHAPS和TBP 均购自 BBI(BIO BASIC INC.)公司;尿素、碘乙酰胺(IAA) 、线性固相 pH梯度预制胶条( pH 4~7 )、矿物油均购自GE公司;DMEM购自GIBCO公司; 新生小牛血清购自上海亿欣生物科技有限公司;Dextron-T500购自Pharmacia 公司;其余试剂为国产分析纯。
1.2 溶液配制
细胞裂解液: 8 M尿素,4% CHAPS,2%两性载体Pharmalyte或IPG缓冲液(载体两性电解质),40 mM DTT, 定容至10 mL,1.0mL/支 分装,储存于-20℃条件下。IPG buffer和DTT现用现加。
样品水化液: 8 M尿素,2% CHAPS,0.5/2%两性载体Pharmalyte或IPG缓冲液,0.002%溴酚蓝, 定容至10 mL,分装为1.0mL溶液储存于-20 ℃条件下。使用前加
[基金项目] 浙江省科学技术厅项目(2009F70028)
[作者简介] 陈小青(1977.2-),男,硕士,主管医师,研究方向:化学物质毒性研究。
入DTT,每1.0mL水化储备溶液中加入2.8mgDTT(FW 154.2,1.8mM)。使用前加入与IPG胶条的范围相同IPG buffer,终浓度0.5%(v/v)。
平衡缓冲液: 6 M尿素,75 mM Tris-HCl pH8.8,29.3%甘油, 2%SDS,0.002%溴酚蓝,定容至100mL。这是储备溶液。在使用之前,按照一定量加入1%DTT(100mg/10mL)或2.5%碘乙酰胺(250mg/10mL),分别用于第一次和第二次平衡。Max用量 10mL/胶条。分装20mL/支,储存于-20℃条件下。
银染试剂:
固定液:乙醇:冰醋酸:水=5:1:4
漂洗液:30%乙醇
敏化液:2.5mmol/L 硫代硫酸钠(0.62g/L Na2S2O3·5水)
银染液:0.5g AgNO3 溶于200μl甲醛中,用去离子水定容至250mL,避光保存。(先配好不含甲醛的储备液,临用前按比例加入甲醛,200μl/250mL银染液)
显色液:2mL敏化液 + 125μl甲醛 + 7.0g Na2CO3 + 去离子水,定容至250mL,每次使用时新鲜配置(先配好不含甲醛的储备液,临用前按比例加入甲醛,
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