分子生物学综合性实验讲稿.doc

分子生物学综合性实验讲稿 生命科学与生物制药学院 生物制药研究所 分子生物学综合性实验教学小组 2008年11月 （非正式出版物，请勿外传） 分子生物学实验内容与流程 实验内容 PBMC总RNA提取 RT-PCR、扩增产物电泳鉴定与纯化 扩增产物克隆 转化子筛选与PCR鉴定 重组质粒提取与酶切鉴定 流程 日期 实验内容 1/12： 2/12: 3/12 4/12 5/12 实验要求与质量控制 综合实验涉及的知识点和实验技术众多，为了培养学生严谨求实、科学求真之精神，并达到综合实验之最大成效，以下对本综合实验过程的要求进行说明，且纳入实验考核成绩。 1、预习 实验前须充分预习，要求随机抽查时，每一位同学能够清晰的阐述整体实验思路和具体的实验项目、原理。 2、实验过程 除了遵守学校与学院一般实验纪律与要求外，还必须做到主动性、能动性与团队精神相接合，利用有限的资源与时间得到最好的培训与实验结果。为此，本综合实验将能否在规定时间内完成实验内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一，并作为考核结果记入实验成绩中。要达到此目的，同学们必须提前仔细阅读实验讲义，全面了解实验内容，透彻理解实验原理，熟悉各个操作步骤，并在实验过程中合理安排时间。 3、实验原始记录与结果整理 每天必须及时、真实、完整地记录当天所做实验情况，记录实验过程中的异常情况，分析其原因，并将下述关键性实验情况整理于实验记录本上，并于当天由带教老师签阅： 记录日期、天气 实验名称、负责人 原理（简述） 实际操作情况 实验结果 分析 4、综合实验报告 须按下述规范撰写、并提交综合实验报告（电子版及电子打印版）。 1）封面： 见下一页。 2)论文内容 目录 中文摘要 英文摘要 前言 材料与方法 结果与讨论 总RNA提取与RT-PCR：PCR产物电泳凝胶扫描图、PCR产物回收电泳凝胶扫描图。 RT-PCR产物克隆：转化筛选平板照片 重组子PCR鉴定：PCR鉴定电泳凝胶扫描图 重组质粒提取与酶切鉴定：酶切鉴定电泳凝胶扫描图 参考文献 致谢 分子生物学综合性实验论文 TCRBV7S1基因片段的克隆 姓名：………… 班级：………… 学号：………… 指导教师：李黄金、陈伟、刘剑、孙艳、杨国柱、王兆玉 广东药学院 生命科学与生物制药学院 实验一 PBMC总RNA提取 实验目的 1．掌握真核细胞总RNA提取的方法与注意事项 2．了解真核细胞总RNA提取的原理 实验原理 RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学科研技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制，已成为分子生物学研究的一个重要手段。利用提取的RNA人们可以对特定的基因表达进行定性和定量检测，从分子水平精确的了解细胞生命活动的规律。 通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5ugRNA，其中约82%为rRNA（主要是28S、18 S和5.8 S、5S四种类型），16%为tRNA和核内小分子RNA，2%为mRNA。这些高峰度的RNA，如rRNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分离。而mRNA虽然大小和核苷酸序列各不相同，从数百至数千碱基不等，但大多数真核细胞mRNA在其3端均有一寡聚腺苷酸(polyA)组成的尾，其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸—纤维素[oligo(dT)] ，使得mRNA可以利用亲和层析法分离。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。 真核细胞总RNA制备方法有多种，包括异硫氰酸胍—氯化铯超速离心法、盐酸胍—有机溶剂法、氯化锂—尿素法、热酚法以及TRIzol试剂提取法等。目前实验室提取总RNA的常用方法为异硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol试剂提取法。异硫氰酸胍法制备真核细胞总RNA，是将已知最强的RNase酶抑制剂异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了核蛋白复合物的解离，使RNA和蛋白质分离并进入溶液，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩。我们这次实验采用的是TRIzol试剂提取法。TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，同时还抑制RNA酶，防止RNA的降解。使蛋白变性 RNA极不稳定，易于降解，而RNA酶几乎无处不在，且特别稳定，故在提取RNA时关键因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力，因此，创造一个无RNA酶的环境，严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。 抑制内源性RNA酶。 主要