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植物中SOD的分离提取及性质研究 --------------------综合实验报告 学校： 学院： 班级： 同组成员： 一、实验目的 SOD广泛存在生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD主要有CuZn-,Mn-,Fe-SOD三种类型的同工酶，它们的共同的生物学作用是专一的清除氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损坏作用），具有抗衰老，抗辐射，抗癌等生理作用。在医药中，SOD可用于治疗辐射病，自身免疫性疾病，炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老，抗炎，防晒等作用。植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并且确定SOD同工酶的类型。根据SOD的性质，我们采用邻苯三酚自氧化法判断同工酶的最适温度，最适PH，以及双氧水对酶的活力抑制。并采用改进的自氧化法测酶的活力. 二、实验原理 1、邻苯三酚自氧化法 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（mg∕mL）;每ml样品中的酶活性单位数（U∕mL）。酶的纯度越高酶的活性也就越高。 SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。 利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加 2、不连续电泳　　 不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得到电泳分离最重要的指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技术。 三、实验试剂 大蒜、氯仿-乙醇混合液、维生素、冷丙酮、邻苯三酚、浓盐酸、蒸馏水、双氧水、TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺。）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、溴酚蓝、5.0mol/L PH7.8 磷酸钠、10 mmol/LHCl、Tris（三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇1．2.45mol/LNBT溶液：称取200mgNBT溶于蒸馏水中并定容至100ml置棕色试剂瓶中，避光贮存。 2. 3.60mol/L PH7.8磷酸缓冲液（内含2.8mol/L TEMED和2.8 维生素）：在100ml 3.60mol/L PH7.8 磷酸钠缓冲液中加0.42mlTEMED及1.32mg维生素 ，置棕色瓶中贮存。 3．PH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g，加水至1000ml,用是加水稀释10倍。 4. PH8.9 1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液：称取18.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris）加24ml 1mol/L盐酸，加水至100ml. 5. PH6.8 0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液:称取Tris6.0g,加48ml 1.0mol/L 盐酸溶液100ml 。 6.以及不同浓度的磷酸缓冲液。0.05mol/L， PH如下 5.8 6.5 7.0 7.3 7.6 7.8 7.9 8.3 7. 凝胶贮液以及凝胶 A液：48ml 1mol/L Hcl,36g Tris,0.24ml TEMED. B液：48ml 1mol/L Hcl,5.9g Tris,0.46ml TEMED。 C液：30g Acr,0.8g Bis D液：10g Acr,2.5g Bis E液：4mg核黄素 F液：40g蔗糖（以上各液定容至100ml） 凝胶（体积比）：A:C:E:水 1:3:1:3 浓缩液（体积比）：B:D:E:F 1:3:1:3 四、实验仪器 离心机 离心管 水浴锅 电热炉 研钵 移液枪 移液管 胶头滴管 试管若干 721型分光光度计以及紫外分光光度计 DYCZ-240D型垂直板电泳槽 锥形瓶 冰箱 不同型号容量瓶若干 托盘天平 烧杯 玻璃棒 五．实验内容 ①制 备 酶 液 ： SOD的提取： 称取20~25g大蒜蒜瓣，置于研磨器中研磨，使组织细胞破碎。再加入2~3倍体积