核酸的制备方案.ppt

核酸制备方案 制作人：顾恒 一、理化性质 二、制备原则 三、提取过程 四、实验步骤 五、注意事项 六、常见问题 一、核酸的理化性质 1、DNA是为白色类似石棉样的纤维状物 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶 二、制备原则 1、分离纯化的总原则 ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 2、纯化达到的要求 ①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 三、提取过程 材料准备 破碎细胞或包膜（释放内容物） 核酸分离纯化 沉淀或吸附核酸，并去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中 四、实验步骤 （一）、选择材料 DNA的来源：小牛胸腺?动物肝脏?鱼类精子，植物种子的胚。 RNA的来源：新鲜组织或细胞。 （二）、破碎细胞 ①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 （三）、抽提核酸，除去杂质 1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白、与其它成分分离。 2．使核酸与蛋白质分离。 3．除去脂类。 4．多糖的除去。 （四）、核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 五、注意事项 （1）、细胞裂解 1、材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 2、高温温浴时，定时轻柔振荡 3、针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 （二）、核酸的分离纯化 1、采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。 2、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。 （三）、核酸沉淀，溶解 1、pH值为8.0，可防止DNA发生酸解。 2、当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。 3、沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等。 六、常见的问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 问题二：DNA降解。 问题三：DNA提取量少。 谢谢！ * * 细胞破碎 提取 纯化 植物种子的胚 新鲜的组织 动物肝脏