氨基酸组成分析.ppt

第三章 氨基酸组成分析 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75～ 200Da之间，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体 内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出 现D型氨基酸。 氨基酸分析技术的发展始于1820年，由Braconnot最早 将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到21世纪，用 化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数 月的繁琐的工作。 色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。 1941年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰 化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、 Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年， Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析 仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是 经典的方法。 第一节 氨基酸组成分析的目的 现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给 定量带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液 在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白 质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分 析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。 另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况， 一种可能是蛋白质的N端封闭， 另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质 物质， 解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品 的成分。 除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学 上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。 第二节 蛋白质的水解方法 氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解，常规方法是采用 5.7mol/L盐酸在真空状况下于110℃水解24h，也有在150℃下快速水 解90min。 Waters公司有商品化仪器(水解工作台)出售。将100～500μmol的 蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中加入 5.7mol/L盐酸200μl，含2％苯酚(m/V)，将指管置于反应器中，抽真 空并充氮气反复三次(图3.1c，真空控制也是实验重复性的一项重要因 素)110℃保温22h。其中，苯酚是作为一种抗氧化剂来防止半胱氨酸 (Cys)和甲硫氨酸(Met)的氧化。如果遇到一些不易裂解的肽键，如 Val—Val，Ile—Leu等，水解时间可适当延长至72h，但长时间水解会 部分破坏含羟基的氨基酸[丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，酪氨酸(Tyr)]。 影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。 水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中 通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素c(Cyt c)、核糖核酸 酶(RNase)或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色 谱分析来计算回收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价 方法的适用性。 但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨 基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的 氨基酸含量只有1～2个，这影响到氨基酸的回收。生物应 用公司（ABI）曾设计过一种“测试肽”，即人工合成18种不 同氨基酸的肽(除Gln、Asn外)，这样每种氨基酸出现的频 率都是1，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以 采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情 况。 第三节 特殊氨基酸的保护和定量 不同条件下，各种氨基酸的回收有所不同，但色氨酸均遭 破坏，通常解决方法有以下5种。 1.水解酸中加添加剂 这些添加剂包括琉基乙酸和β-琉基乙醇，我们通过实验 认为液相水解时加入巯基乙醇对色氨酸保护效果较好，色氨 酸的回收可达80％。有报道Perkin-Elmer公司针对其产品 ABI420A的特点，推出试剂十二烷基硫醇，专门保护色氨 酸，据称回收率达97％。 2.有机酸 3mol/L 巯基乙磺酸(mercaptoethanesulfonic acid) 或4mol/L甲磺酸(methane-sul-fonie acid)在水解时对色 氨酸有一定的保护作用。 3．碱 用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。 4．酶 蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和，对天冬酰胺和谷氨 酰胺及色氨酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全，必须用酸水解法 校正。 5．光谱法 分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早，在蛋白 质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其 在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含 量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸