种子制备与菌种保藏.ppt

第四章 种子制备与菌种保藏 第一节 种子制备（Inoculum development） 定义：由保藏的菌种开始，经过逐级扩大培养，最后获得供生产车间发酵罐接种的的足够数量和优质质量的种子。 生产菌种的必备条件： 1 生长快： 2 对环境条件要有比较大的承受能力 3 遗传表现型要稳定，不易退化 4 菌种要纯 几个概念 种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。 发酵级数：种子罐的级数加一。 接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。 种龄：生产种子的培养时间。 一 斜面种子的制备 1.斜面种子：在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。 2. 制备流程： 3. 制备过程注意事项 (1)??琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5% ( 2) 营养液中最好不含易沉淀的固形物； (3) 装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3； (4) 灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水 (5) 微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入 3. 质量检查 (1)??外观检查 ( 2)??无菌检查 ( 3)摇瓶生产能力检查 4.影响斜面种子质量的因素 (1)原材料质量，水质，培养基pH， (2)灭菌条件， (3)接种量， (4)培养室温度、湿度、通风、 (5)培养时间， (6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯） (7) 冷藏条件 二 、米粒种子（米孢子） 1. 米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。 2 . 米孢子制备工艺流程 3.?制备过程注意事项 （1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连； （2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度 （3）米粒不要碰到瓶塞； （4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。 （5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存 4. 质量标准 （1）无杂菌污染 （2）孢子数足够，发芽率高 （3）生产能力高 (4) 真空干燥后含水量小于8% 5. 影响质量的因素及控制（同前） 三、种曲（培养材料用麸皮、米糠等，其余同米粒种子） 四、摇瓶种子 1.摇瓶种子 : 将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。 2.制备流程 : 3.制备过程注意事项 培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。 培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50 ml/ 250 ml瓶，60-80 ml/ 500 ml瓶，90-110 ml/ 750 ml瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上； 3) 灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上 4） 注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧。 5） 注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差 摇瓶种子制备流程 3.质量检查： ( 1)? 菌体浓度：外观稠度，静置沉降率，离心沉降率。 ( 2)??菌体生长阶段：显微镜检查细胞分化情况。 ( 3) 代谢情况：对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值。 ( 4)??生产能力：摇瓶发酵试验。 ( 5)??污染杂菌情况：镜检及无菌试验检查 4. 影响质量的因素 五、发酵罐种子 1.制备流程 ： ??????? 斜面、摇瓶或米粒种子 ↓ 培养基配制 → 实罐或连续灭菌 → 冷却 → 火圈或压力差接种 →培养→ 发酵罐种子 2 .制备过程注意事项 培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶培养基丰富， 控制培养基成份的合理配比， 2) 接种方式： 一级种子罐：火圈保护接种法和压差法 二级种子罐：压差法 3）通气培养时通入空气的温度适中（20-50℃），搅拌转速也要适当。 4）采用夹套或蛇管冷却以保持恒温，温度不能高于控制温度，防止造成异常发酵 5） 通过培养基中生理酸碱性物质的配比，使pH自然维持在适宜的范围 6）控制合适移种量： 确定合适的移种量：过大或过小