线粒体相关研究.ppt

Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 二、流式细胞术 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。 三、细胞电泳 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同 。 用途：检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。 第四节 细胞培养与细胞杂交 一、细胞培养 （一）动物细胞培养 群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层； 克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。 转鼓培养法：为制取细胞产品而设计，大容量旋转培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。 原代培养 （primary culture）：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养（Passage）。 细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 表三、实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 Henrietta Lacks BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP2／0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 （二）植物细胞培养 外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。 悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。 原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点： ①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； ②便于进行细胞融合，形成杂交细胞； ③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。 Plant Cell Culture Animal Cell Culture 二、细胞融合 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 同核体：相同基因型的细胞融合而成。 异核体：不同基因型的细胞融合而成。 自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。 单克隆抗体技术 正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。 2）负染技术 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 Negative Stained Actin 3）冰冻蚀刻 freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。 A Yeast Cell 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 （二）扫描电子显微镜 Scanning electron microscope（ SEM