3-4基因工程制药.ppt

（六）基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 工程菌遗传不稳定性的表现形式 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列表现形式： 结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其生物学功能的丧失 分配不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing） 宿主细胞突变 1.缺失突变引起的质粒不稳定性：现已观察到在许多质粒DNA中存在着自发缺失的现象；人工构建的具有多个串联启动子的质粒载体特别容易发生缺失作用。 *2.重组作用引起的质粒不稳定性：①一方面存在质粒载体位点之间的同源重组；②另一方面大肠杆菌寄主染色体与质粒载体上的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。这是由于通过IS序列和转位因子的插入作用、邻位缺失或DNA倒位，都有可能使质粒载体产生自发突变。 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 工程菌遗传不稳定性的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢：能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配：这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 重组质粒的逃逸率 当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为称为重组质粒的宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）促使重组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒：重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒减少 拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧 改善基因工程菌不稳定性的策略 改进载体受体系统 以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括： 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因） 改善基因工程菌不稳定性的策略 施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高 改善基因工程菌不稳定性的策略 两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。 控制目的基因的过量表达：可控型启动子、可控型复制子 优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定 固定化 （七）利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： 直接提取法制人胰岛素 早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。 人胰岛素的生产方法 化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。 人胰岛素的生产方法 化学转型法制人胰岛素 猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。 上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。 人胰岛素的生产方法 基因工程法制人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免