VNTR分子指纹分型法在结核分枝杆菌北京基因型菌株识别中应用.pdfVIP

第十次全黧感染病学术会议蹙第二届全国感染料医师大会 A3、YNTR分子指纹分型法 在结核分枝杆菌北京基因型菌株识别咿韵应用 上海复旦大学附属华山医院传染科(200040)金嘉琳张文宏翁心华 上海市复旦大学遗传所姜．昕 上海市肺科医院胡忠义 分子指纹图谱分析研究发现在结核耐药菌株的感染与传播中北京基因型菌株是主要的组成成 分，约占全邀界结核墓株1／4，在中匡更楚占780％良上的比例【l】。由予=||：京基因型蘸株掌掌与耐 多药菌株的流行相关，早期识别十分重要。IS6110一RFLP分型技术被认为是结核杆菌基因型分型的 金标准。它是基予基因组中IS6110插入序歹|j的数照和位鬣的差异箍区分不同豹菌株，已经证睨蠢较 高的分辨率和重复性。但怒由于其需要高质量和较多数鬃的DNA，操作复杂，实际应用受到一定限 制。近年来发展起来的VNTR(VariableNumberofTandem 数目可变串联重复单元)指纹 Repeats， 分型法建立在多态性的基础上，是～种新整的结核菌指纹分型法，具有简单、快速、分辨率较离等 特点。但是VNTR分型法与结核杆荣北京基因型菌株识别的关系还不清楚。本文应用VNTR方法对临 床结核菌株进行分型，探讨VNTR分型法在北京基因型结核菌株识别中的应用，并与另一种间隔区寡 核替酸分型法(Sp01igot”ing)进行比较。 材料葛方法 一、菌株来源及药敏结果 本文研究所用50株结核分支杆菌菌株由上海市肺科医院菌株库提供。 二、基因组DNA的提取 病人的疲标本处理消纯后接种子改良罗氏培养基上，37℃墙养一个露看，取少量细菌∞℃永浴 过夜灭活。 应用上海华舜生物技术有限公司的小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(w65l1)，提取 DNA溶液约l溉l。 三、VNTR分型法进行分型 {、多态标记VNTR位赢及引物： 合成。 2、PcR反应 Il 每株菌株分剐以12对弓I物在不同的反应体系中进行扩增。采用50l扩增体系，包括上游及下 pM，dNTP 2 游引物各0。4 u 200“M，重组taqDNA聚合酶2．5u(TakaraCompany)，模板DNA l。在Mastercyclerpersonal(EppendorfCompany，Germany)PCR循环仪上扩增。除TMIRU24位 点以外其他位点反应体系采用以下的反应条件1：94℃预变性5min； 94℃lmin，55℃lmin，72℃90s，40个循环，最后72℃延伸lOmin。 3、 冀羧大小的确定及基因型分析 PCR产物在1．5％琼脂糖凝胶中，7V／cm电压，90分钟电泳后，经0．5mg／Ill溴化乙啶染色，紫外 DNA 光下观察结果。每S个泳道热lOObp 增产物作为对照，赢接观察并判读条带的大小。与H37Rv标准株对照比较并根据备位点熏复片段大小 ．179— 第卡次全嚣感染病学零会议鬣第二藩全潜感染秘医努大会 推断等位片段中重复摹位的数垦。冬位点等位片段数譬组会成VNTR指纹图谱。 四、SpoIigotyping分型法 参照文献方法【3】基础上稍作修改。PCR方法以寡核昔酸引物扩增DR区域。采用25斗l反应体系， 反应条件如下：96℃预交性15mim 套43个膜固定的寡核苷酸杂交，每～个均对应DR位点内唯一的间隔DNA序列。杂交以后在2XSSPE-- 0．5％十二烷基硫酸钠溶液中60℃洗膜2次，共lO分钟，(1×ssPE即O．18M氯