分子克隆常用载体.pptVIP

cI阻遏基因编码的阻遏物与操纵基因结合，使RNA聚合酶无法使用启动子进行转录。这种状态有充分的能力使原噬菌体保持关闭的状态，这就是溶源性细菌能不停生长而不发生溶菌裂解的原因所在。 这两种不同的λ噬菌体派生载体具有不同的特点，因此在基因克隆中的用途也不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA的插入，广泛应用于cDNA和小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA的插入，所以适用于克隆高等生物的染色体DNA。 野生型的λ基因组中，编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。 根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，尾部基因发生了突变的噬菌体只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的原理。 M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，在颗粒中包装的仅是（+）链的DNA。当感染的M13噬菌体颗粒穿过性须是，其外层主要外壳蛋白质便会脱落，余下的M13（+）链DNA进入到大肠杆菌寄主细胞内。进入细胞内部的M13（+）链DNA起到模板的作用，在宿主胞内酶的作用下，合成出互补的（-）链DNA。几轮复制后，基因II的产物便在RF DNA的正链特定位点上作切割反应，形成一个缺口。新合成的（+）链DNA便会被切除下去，环化形成单位长度的M13基因组DNA。 实验发现，一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞当中时，它们之间便会形成共合体。因此，假若柯斯质粒与质粒各自具有一个互不相同的抗药性记号及相容性的复制起点，那么当它们转化到同一寄主细胞之后，便可容易地筛选出含有两个不同选择记号的共合体分子。 分子克隆常用载体 质粒载体 噬菌体载体 柯斯载体 酵母细胞的克隆载体 一、质粒载体 理想的质粒载体必须具备的基本条件 1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因 3、具有若干限制酶单一识别位点 4、具有较小的分子量和较多的拷贝数 重要的大肠杆菌质粒载体 pSC101质粒载体； ColE 1质粒载体； pBR322质粒载体； pUC质粒载体； T载体 pUCm-T质粒图谱 pUCm-T载体序列 二、噬菌体载体 噬菌体的生命周期 （1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体） （2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体） （1）烈性噬菌体的生活周期 （2）温和噬菌体的生活周期 裂解循环 溶源态 重要的噬菌体载体 一、λ噬菌体载体 （1）插入型载体：有单一酶切点,便于外源DNA插入 （2）替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之间λ DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代 λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。 注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 36kb ~ 51kb。 体外包装：λ噬菌体载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白 头部基因（琥珀突变型） 尾部基因（琥珀突变型） 转录复制蛋白质合成 组装尾部所需要的组分 “无头部”的提取物 组装头部所需要的组分 “无尾部”的提取物 温育 转录复制蛋白质合成 体外包装的重组DNA比裸露的DNA导入受体细胞的效率高100-10000倍 sup-细菌 完整的噬菌体 二、M13噬菌体载体 M13是丝状噬菌体，有长约6500个核苷酸的闭环DNA基因组。M13附着在大肠杆菌的F性菌毛上，所以它们只能感染雄性细菌。不过M13噬菌体DNA亦可通过转染作用导入雌性大肠杆菌细胞。 1.M13噬菌体作为载体优越性 （1）单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA。 （2）不论是RF DNA还是ss DNA，它们都能转染感受态的大肠杆菌寄主细胞。 （3）单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的大小制约的，因此不存在包装限制问题。 （4）可产生大量纯化的含外源片断的单链DNA分子。 2.M13载体筛选方法 插入→α-多肽→互补于受体细胞→半乳糖苷酶 未插入→α-多肽→互补于受体细胞→半乳糖苷酶 无色噬菌斑←不分解X-gal(IPTG) 蓝色色噬菌斑←分解X-gal(IPTG) 3.M13噬菌体载体的优点 与其它载体相比，M13载体具有两个十分有用的优点： ①这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列。 ②M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可以有效地克隆双链DNA分子的每一条链。 三、柯斯质粒载体 1.柯斯载体的组成 由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。  2、Cosmid载体特点： （1）具有λ