基因克隆-2.pptVIP

基因工程及体外表达体系（2）.载体 心血管病研究所 王 佐 一、概述 外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的细胞区分开来。 外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段扩增的目的。 1载体（vector） 携带靶DNA片段（外源DNA片段）进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 2载体的特征： 能自主复制； 具备筛选标记； 适当大小的分子量和适当限制性内切酶酶切位点； 在细胞中拷贝数高 除上述特征外，表达载体还应配备有与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、加尾信号、增强子等调控DNA元件。 3 载体的分类 按来源分：质粒、噬菌体、病毒载体等； 按用途和功能分：克隆载体和表达载体。 克隆载体与表达载体 克隆载体：主要用来获得大量纯化的目的DNA片段（目的基因），以便进一步研究其结构和功能；本章主要以克隆载体为例讲解。 表达载体：主要用来产生插入基因和mRNA，进而合成相关蛋白质。 二、质粒载体 Plasmid：细菌染色体外小型双链环状DNA，对细菌的某些代谢活动和抗药性的表型具有一定的作用。 2 严紧型质粒与松驰型质粒的区别 3 Specificity of Plasmid Vectors Autonomously replicating DNA molecules (have an origin of replication) Selectable marker, such as drug resistance Insertion site for foreign DNA (often a genetically engineered multiple cloning region with sites for several restriction enzymes) multiple cloning sites 人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性内切酶识别序列，以利于不同来源的外源DNA片段插入载体。 6 pUC系列载体 由pBR质粒与M13噬菌体构建成的双链DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。 主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、复制起始点（ori） （2）筛选原理及方法 含有来自大肠杆菌的lacZ操纵子的DNA片段（lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。 外源基因插入载体后，lacZ被破坏，不能分解X-gal，菌落呈白色。——“蓝白斑”筛选法。 7质粒载体的主要用途 保存和扩增片段小于2kb的DNA； 构建cDNA文库； 目的DNA测序； 制备探针。 三、λ噬菌体载体 λ噬菌体的基因组是约50kb的线性双链DNA分子，两端各有12个核苷酸的5’突出，碱基互补（cos位点，又称粘端）。 λ噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。 1λ噬菌体在细菌内的生长方式： 裂菌性生长（lytic pathway）：在宿主菌中大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主菌裂解。 溶菌性生长（lysogenic pathway）：整合到宿主菌DNA分子中，随宿主菌DNA复制并转到子代细菌中。 2λ噬菌体结构 DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插入外源基因的长度范围为15～25kb。 3 插入载体 经人工改造而成，具有单一的EcoRⅠ酶切位点，该酶切位点位于lacZ基因内，使用蓝白斑筛选法。插入片段长度约几个kb，主要用于构建cDNA文库。 此载体中央部分两端有三个酶切位点。可插入片段的长度约9～22kb，主要用于构建基因组文库。 不足： λ噬菌体载体在进行真核基因组文库构建时，其容量仍然受到一定的限制。最大插入片段不能超过23kb。 四、粘粒载体 1978年构建，由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建而成。插入片段29～45kb。可根据载体携带的抗药性标记筛选阳性克隆细胞株。 构成：质粒复制起始点、一个或多个限制性内切酶位点、抗药性基因、λ噬菌体的cos位点。粘粒载体大小为4～6kb。 粘粒克隆外源DNA的步骤：