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化 学 合 成 基因序列已知 同源蛋白基因 文库是将某一物种基因组DNA或cDNA以克隆的方式（质粒或噬菌体）保存在大肠杆菌中的方式。 构建cDNA文库 文库筛选 免疫学筛选 目的基因表达 目的基因在宿主细胞中的表达需具备如下几个特点： 1.完整的表达框（启动子-核糖体结合位点-目的基因-标签-转录终止子）。其中选择组成型、组织器官特异性、发育特异性和环境诱导型启动子可以控制目的基因的特殊表达模式的需求。原核表达需要用SD序列作为核糖体结合位点，而真核表达需要有帽子位点即可。 2. 控制表达水平，尽量减少蛋白产物对宿主细胞的正常生活的干扰，产生分泌蛋白是一个不错的选择， 3.为了方便检测和纯化蛋白产物，可以表达一个融合标签（HA、HISx6、C-Myc、 Flag、 GST等）。 原核表达体系 真核表达体系 体外转录翻译体系 表达载体 SDSof the lysate of uninduced and induced host bacteria?E. coli?BL21(DE3) containing the control expression vector or the recombinant expression vector and the purified recombinant protein.?M?protein marker,?1?lysate of?E. coli?BL21(DE3) containing pET-30a(+) without IPTG induction,?2?pET-30a(+) with IPTG induction,?3?pET-30a(+)-CsTRIP-1 without IPTG induction,?4?pET-30a(+)-CsTRIP-1 with IPTG induction,?5the purified recombinant?CsTRIP-1 protein * * 包括下列过程（1）高分子量染色体DNA的制备；（2）体外重组连接；（3）包装蛋白的制备；（4）重组体的体外包装；（5）将重组DNA导入寄主细胞；（6）筛选。 载体的分类 根据用途可以分为： 克隆载体：在宿主细胞内高保真地大规模复制。 测序载体：用于测定DNA序列。 表达载体：用于外源基因的表达。 尽管如此，“三合一”的载体目前经常用。 根据来源不同可以分为： 质粒载体，病毒载体，人工染色体 载体的基本条件 1、能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制。 2、具有合适的多种限制酶的单一切点。 3、具有适宜的筛选标记。 4、相对分子质量小，细胞内拷贝数要多。 5、在细胞内稳定性高，易分离纯化。 载体结构 多克隆位点，容许外源基因插入的合法位点 宿主细胞能识别的复制起始序列，如果含有两种以上复制起始位点，则为穿梭载体 筛选标记：抗生素分解基因（Amp, Km等）、报告基因（GUS, GFP, LUC,LacZ）。这些基因多为组成型启动子控制，恒定表达。 启动子（宿主细胞能识别的启动子） 终止子（转录终止序列，多来自宿主细胞病毒和细菌） 体外重组重组DNA向宿主细胞导入 Recombinant DNA 重组 重组是通过T4 DNA连接酶将目的DNA片段插入到载体相应位点的DNA重组过程。通过优化连接参数可以获得高的连接效果。具体如下： 1. 插入片段摩尔数要多于载体摩尔数（3-10倍）； 2. 平末端连接采用低温（4-8度过夜），而黏性末端在室温下连接几小时或16度连接过夜。 3. 连接体系一般为10-20微升，体积过大过小会影响连接效率。 4.可以用T4 RNA 连接酶连接单链的DNA 分子。 体外重组线路图 导入重组体主要方法 物理学方法：微注射技术、基因枪技术、电转 化法（电穿孔术）、超声波 化学方法：CaCl2低渗转化大肠杆菌、脂质体介导法、PEG介导 生物媒介方法： 病毒介导法、农杆菌介导转基因方法 转化原理 负对照 实验组 正对照 蓝白筛选结果 根癌农杆菌介导转化植物的方法 1. 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)的一般性质： 冠瘿病 Ti质粒（Tumor inducing plasmid) T-DNA (Tramsferred DNA)区 Vir区 * 冠瘿瘤的特点： 激素自主性 冠瘿碱幻灯片5 无正常分化能力