基础科学探讨 — 生物作业1.docVIP

基礎科學探討 — 生物作業1 題目：植物蛋白質之抽取與設定 授課老師：林忠毅 教授 學生：李杰祚 971201016 王堃泰 971201019 郭明田 971201009 （本次作業主筆人：郭明田) 日期：Dec-23 2008 目的：一般常用的蛋白質定量分析方法，是利用試劑與蛋白質作用並產生顏色變化，其變化成度與蛋白質濃度有線性相關，本實驗抽取植物蛋白質，並將蛋白質定量。 原理：蛋白質分可溶與不可溶兩種，一般以抽取可溶蛋白質為主，抽取蛋白質方法，是將組織加緩衝液於研砵內低溫打碎，再以離心去除細胞碎片、殘渣，取上層澄清液，即可測得蛋白質含量，本實驗是用Biuret方法， 含銅離子藍紫色於鹼性環境下進行，吸光值越大含蛋白質含量越多。 材料：綠豆幼苗根、子葉 各0.3g 磷酸緩衝液 （ph 6.8) 4mL 研砵（預冷) 1個 離心管 2支 冰塊 1盆 冷凍離心機 1台 移液管 1支 牛血清蛋白溶液 步驟：1.將綠豆幼苗根、子葉各取0.3g，加入磷酸緩衝液 （ph 6.8) 4mL，於冰的研砵中研磨。 2.研磨好的綠豆幼苗根、子葉用滴管放入離心管中，兩支離心管的容量要一樣。 3.用離心機離心10-15分鐘，細胞碎片、殘渣會在下層，取上層澄清液10uL，來測量蛋白質含量。 4.各取根、子葉上層澄清液10uL，加入銅離子試劑中，靜置10分鐘。 5.用儀器測量其吸光值。 數據： 牛血清蛋白溶液為標準曲線數據： 牛血清蛋白溶液 0.01﹪ 0.02﹪ 0.04﹪ 0.08﹪ 吸光值 0.449 0.452 0.475 0.519 靜置10分鐘所得根、子葉吸光值數據： 子葉 根 吸光值 0.334 0.342 圖表： 結論： （1）子葉與根的吸光值偏低（0.334，0.342 )，用迴歸方程式可算出其蛋白質濃度為0.01﹪以下。 （2）分析吸光值偏低的原因，取根、子葉上層澄清液10uL，加入銅離子試劑中，靜置10分鐘的時間太短，應靜置30分鐘，使反應作用完整，吸光值可能會提高。 （3）吸光值與蛋白質濃度呈正比。吸光值越高蛋白質濃度也越高。 問題討論：蛋白質定量還有什麼方法？ （1）ＵＶ吸光法： 一般有機物質在波長250nm以下才會吸光，建立濃度與吸光值標準曲線的相關公式，得吸光值而反求濃度。 （2）Biuret 法：銅離子在鹼性溶液中，會與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合，生成紫色的複合物；兩個 carbonyl 與一個銅離子結合成類似 biuret 的複合体。 其精確度較差，且會受樣本中硫酸銨及Tris的干擾，但準確度較高，不受蛋白質的種類影響。 補充資料： 一般蛋白質會吸收兩種波長的紫外光： (1) ?210 nm光波：胜肽鍵 (peptide bond) 的吸收峰。(2) ?280 nm光波：芳香環側鏈的胺基酸的吸收峰。一般想定量蛋白質可用UV吸光法 (就是檢測對上述波長的吸光程度而定量)或是化學成色法 (如雙尿法、Lowry法等)。Sheet3 Sheet2 Sheet1 Chart2 0.04﹪ 0.02﹪ 0.01﹪ 0.08﹪ 子葉 根 子葉 .33 根 .34 0.01﹪ .45 0.02﹪ .45 0.04﹪ .48 0.08﹪ .52 濃度 吸光值 牛血清蛋白質吸光值標準曲線 y = 0.1618x R2 = -35.849 濃度 吸光值 子葉根與標準曲線比較圖 濃度 吸光值 子葉根與標準曲線比較圖 子葉 根 0.01﹪ 0.02﹪ 0.04﹪ 0.08﹪ .33 .34 .45 .45 .48 .52 Sheet3 Sheet2 Sheet1 Chart2 牛血清蛋白溶液 吸光值 子葉 根 1.00E-04 2.00E-04 4.00E-04 8.00E-04 .45 .45 .48 .52 .36 .40 牛血清蛋白溶液濃度 吸光值 牛血清蛋白溶液濃度 吸光值 1.00E-04 2.00E-04 4.00E-04 8.00E-04 .45 .45 .48 .52