16S+rRNA序列分析在多杀巴斯德氏菌鉴定中应用.pdfVIP

·18· 北方实验动物科技年会·实验动物科学国际论坛 2009年10月 16S rRNA序列分析在多杀巴斯德氏茵鉴定中的应用 高正琴1 张 强1 邢 进1 岳秉飞1 贺争鸣1 (1．中国药品生物制品检定所，北京100050；2．首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069) 摘要：目的应用16srBNA序列分析方法，对多杀巴斯德氏菌进行鉴定。方法采集猝死家兔样本，进行病理组织 学检查和病原菌分离培养。针对细菌16SrRNA基因保守区序列设计一对引物，以分离菌株抽提的DNA为模板， 进行PCR扩增及16S rRNA序列分析。结果从死亡家兔肺脏中分离鉴定出了一株多杀巴斯德氏菌(PMr090I)。 PM70的16SrRNA核苷酸同源性大于99％。分离菌株对阿莫西林／克拉维酸、头孢曲松、左氧沙星、四环素敏感， 16s 而对青霉素G已产生耐药性。结论 rRNA序列分析的分子生物学方法可用于病原菌的鉴定。 关键词：16SrRNA；多杀巴斯德氏菌；鉴定 16S rRNA基因存在于细菌及衣原体、立克次 体、支原体、螺旋体、放线菌等原核生物的染色体基 1材料和方法 因中，不存在于病毒、真菌等非原核生物体内。有细 菌“分子化石”之称的16SrRNA在其碱基组成、核1．1培养基和试剂 苷酸序列、高级结构及生物功能等方面表现出进化 微厌氧培养系统由El本三菱瓦斯化学株式会社 上的高度保守性。这种进化与保守的二重性，使其 提供。血琼脂培养基、水解酪蛋白血琼脂培养基 成为目前微生物系统分类研究中最有用和最常用的 (MHA琼脂)、MH肉汤、葡萄糖、硝酸盐、尿素等生 “分子计时钟”。16SrRNA具有以下特点：多信息化反应培养基，由本所培养基室提供。Nutrient (其基因核苷酸序列具有高度保守性：同一科、属、 Broth No．2为英国OXOID公司产品。药敏纸片购 种间细菌16SrRNA基因同源性达94％一97％以 Mix— 自北京天坛药物生物技术开发公司。dNTP 上，但它的保守性又是相对的，在保守区之间存在9 EX ture，TaKaRa 一10个变异区，不同科、种、属间都具有一定的变 取试剂盒、DNA纯化试剂盒为大连宝生物工程有限 异，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性 公司产品。 极高)、多拷贝(每个细菌约含5一lO个拷贝，这使 1．2剖检变化 得对该基因的检测具有敏感性)、大小适中(约1500 家兔的气管黏膜充血、出血，气管内有大量血色 rRNA编码基因 bp，便于序列测定分析比对)。16S 泡沫状物充斥；胸腔内有血样渗出液；淋巴结和脾脏 的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序 肿大、出血；肺水肿、充血、出血；肝肿大、变性，有许 列，逐渐成为细菌鉴别、分类的金标准。随着基因组 多小的坏死灶。 学的迅猛发展，几乎所有病原菌的16SrRNA基因 1．3细菌学检查 测序均已完成，其对16SrRNA基因序列的分析，适 取家兔的心血涂片、肺脏触片，进行革兰染色和 用于确定属及