HIV-1前体蛋白早成熟化激活剂筛选模型的建立应用.pdfVIP

HIV．1前体蛋白早成熟化激活剂筛选模型的建立及应用 张全李晓字刘振龙贾平平魏晓露赵立勋蒋建东岑山· (中国医学科学院医药生物技术研究所免疫生物学室北京100050) 摘 要：HIV-1蛋白酶(PR)活性的严格调控对于病毒的生存至关重要：在病毒蛋白表达 及病毒颗粒装配过程中，处于病毒前体蛋白Gag．Pol中的蛋白酶必须以无活性状态存在，避免 前体蛋白Gag．Pol和Gag被提前酶切加工(前体蛋白早成熟化)。干扰HIV-1蛋白酶活性的调 控机制，特异性地激活前体蛋白中的蛋白酶，诱导前体蛋白早成熟化，就可以直接抑制病毒的 复制。本课题根据这一设想，运用生物发光共振能量转移(BRET)技术，建立了细胞水平的 HIV-I前体蛋白早成熟化激活剂筛选模型。本工作中，我们构建和表达融合蛋白 入HIV-I蛋白酶剪切位点(p2／p7序列)。该模型的工作原理为，当加入Rluc底物，将产生发射光 (70475nm)，Rluc催化产生的光波发生能量转移，激发同处于融合蛋白中的受体EYFP,产生 激发光(九咖～535 成为两个独立的蛋白。两者从融合状态改变成分离状态将直接阻断了能量转移，导致BRET比 行了Western Blot分析和BRET比值测定。结果证实了Gag．Pol中的蛋白酶活化之后，可以酶 切p2／p7序列，并相应地引起BRET比值的下降。当在p2／p7序列进行了点突变，使得HIV一1蛋 白酶不能酶切该序列，则BRET比值基本不变，验证上述实验现象是HIV．1蛋白酶特异性酶切 细胞内被激活的HIVol蛋白酶增多。与该结果相吻合，EFV和TMC．125处理可以明显下调 模型的阳性对照药物，对筛选模型进行了评价。研究结果表明该筛选方法灵敏可靠，特异性高， 重复性好亿，因子为0．905)，达到高通量筛选模型的统计学要求。最后应用该模型对我所的化 合物库进行了初步的筛选(2000个化合物)，其中初筛阳性化合物3个，阳性率为0．15％。目前， 艾滋病的防治主要是依靠药物治疗。临床上使用的抗HIV-I的药物均针对新产生的病毒，阻止 新病毒感染新的细胞，但无法清除感染的细胞。本研究选择HIV-I前体蛋白早成熟化作为抗 HIV-1药物靶点，以期获得可以激活前体蛋白早成熟化的新型抗HIV-I药物。这一新型抗病毒 药物可以提前激活Gag—Pol中的蛋白酶，直接抑制病毒的装配。同时，由于蛋白酶具有细胞毒 性，胄邑引起细胞凋亡，所以有可能清除被病毒感染的细胞，从源头上抑制病毒的生长，将成为根 除艾滋病的化学药物治疗的发展方向之一。 关键词：艾滋病；抗HIV-1药物；筛选模型；蛋白酶；前体蛋白；早成熟化 艾滋病防治工作目前主要依靠于抗HIV-1药物治疗，但由于HIV-I高变异而导致的耐药 性问题，严重制约了传统抗HIVol药物的应用…。因此，亟待发展针对新靶标，具有新作用机制 的抗HIV-I药物，以解决目前HIV-l多重和交叉耐药的问题。 HIV-1蛋白酶(protease，PR)是由HIV-1pol基因5’端所编码。该酶含99个氨基酸，属天冬 氨酸蛋白酶。全酶为旋光对称的同源二聚体，而二者界面形成酶活性中心【23J。HIV-1蛋白酶作 Gag—Pol通过与HIV-1另一前体蛋白Gag相互结合，形成未成熟的病毒颗粒。病毒颗粒装配完 45 成后，在病毒出芽或者出芽后的瞬间，Gag—Pol中的蛋白酶被激活，将Gag—Pol和Gag剪切成为 较小的成熟结构蛋白和酶(包括逆转录酶和整合酶)，这个过程称为病毒㈣4Lt4．5】。只有经 过蛋白酶酶切加工形成的成熟病毒颗粒才具有感染性【6】。 HIV-I蛋白酶活性的严格调控对于病毒的生存至关重要【7，8’9】。研究表明，如果Gag—Pol中 的蛋白酶在装配完成前被激活，会导致前体蛋白Gag．Pol和Gag被提前酶切加工，这一过程被 统称为前体蛋白早成熟化(premature)。一旦发生前体蛋白早成熟化，病毒颗粒便无法装配，因 此病毒颗粒的产量将显著减少，甚至无病毒颗粒产生【8l们。目前，HIV-1病毒装配完成前，细胞 内Gag．Pol中蛋白酶活性的抑制机制，以及装配完成后，蛋白酶被迅速激活的机制尚不清除15,61 尽管如此，如果能干扰HIV-1蛋白酶活性的调控机制，特异性的激活前体蛋白中的蛋白酶，诱 导前体蛋白早成熟化，就可以直接抑制病毒的复制； resona