HIV-2+gp36重组抗原的制备及其在HIV诊断中应用.pdfVIP

HIV-2 gp36重组抗原的制备及其 在HIV诊断中的应用 张昕1梁权2王缦2 l、华东理工大学生物工程学院生物化学与分子生物学，上海，200237 2、上海科华生物工程股份有限公司，上海，200233 摘要目的将HIV-2的跨膜蛋白gp36进行截短与串联，表达出的目的蛋白用于HIV体外检测。 I和Xho 方法PCR方法扩增序列，产物经BamH I双酶切后，分别连入pET32a、pET28MBP质粒，得 到两株重组表达载体，分别导入表达宿主细胞，经IPTG诱导表达出两株目的蛋白。结果扩增出目 的片段，得到正确的重组载体，并表达出与理论分子量一致的两种融合蛋白，用于ELISA检测相应抗 体具有良好的敏感性和特异性。结论构建出可用于HIV检测的gp36表达载体，为跨膜蛋白gp36的进 一步应用研究奠定基础。 关键词HW-2．gp3重组抗原；ELISA 艾滋病的病原体，即人类免疫缺陷病毒，根据 下游：5’ 序列和血清反应的不同，可分为HIV-l和HIV．2两种TCCAACAG 类型，它们的基因序列相差达55％f1，2l。HIV结构基因TATCTGCAAGATCAGGCGCAG3’、FB下游：5’ gag、eIlV的编码产物均可诱导机体产生特异性的抗 3’。第二 体，因此，用特异性抗原来检测患者血清中的相应抗 体是诊断HIV感染的主要方法【3】。目前，临床上用于 和FB下游引物进行扩增得到片段F。扩增产物用上海生 HIV感染筛查实验最广泛的是ELISA检测病毒抗体，而 工生物工程有限公司生产的UNIQ．10柱式PCR产物纯化 针对HIV-2的特异性抗原最常用的是相对保守又具有较试剂盒回收。 高抗原性的跨膜区蛋白gp36[4】。本实验旨在利用基因 4．表达质粒的构建 工程手段，制备出可用于抗体检测的HIV-2 gp36重组蛋 白。 公司的BamHI酶和XhoI酶进行双酶切；将回收得到 一、材料与方法 接，得到两种连接产物：Fl和F4,各自转化DH5Ⅱ菌 1．质粒、菌种 株，从平板上挑取菌落，抽取阳性重组子质粒，转化 pET32a表达质粒购flNovagen公司；pET28MBP表BL21DE3菌株。 达质粒、大肠杆菌菌株DH5Q和BL21DE3均由本实验5．重组蛋白的诱导 室保存。 2．主要试剂 LB培养基中，次日取10mLh100扩大培养至A600约为 HIV-2抗体检测敏感性标本血清为上海科华生物 工程股份有限公司内部质控品；l份假阳性标本、2份 gp36单克隆抗体、200份阴性血清均由本实验室保存。 6．目的蛋白的纯化 7．4PBS缓冲溶液悬浮后超声裂 3．引物设计与目的片段扩增 得到的菌体以pH 目的片段的扩增采用PCR方法，首轮以 解，超声功率设为400W，超声4s，间歇6s，200个循 HIV．2序列为模板，选择其中两个片段(FA、 环，而后l FB)进行扩增。引物分别为FA上游：5’淀。沉淀包涵体使用8M尿素溶解，通过Qiagen公司的 GGCGGATCCGACGGATCTGCAATGGGC3，、 FA Ni．NTA Agarose进行纯化。