T-RFLP在水生动物微生态研究中应用.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第四届第九次学术研讨会论文集(上册)(2008年河南新乡) 性物质的优点。但是，微生物的降解、粘附去除毒素的机理仍需进一步的研究。 参考文献(编者略) T-RFLP在水生动物微生态研究中的应用 王益平倪学勤 (四川农业大学动物微生态实验室四川雅安625014) 在微生态研究中，常见的研究方法主要包括一些传统的方法和新兴的分子生物学技术，它们各 有各自的特点．传统方法主要是通过微生物的选择性培养，再进行鉴定和分类．培养技术只能定量 检测可培养的细菌，不能鉴定未知的细菌，低估了正常菌群的数量和多样性，同时不能阐明微生物 之间或与宿主、环境的相互关系。而且培养方法费时、费力，易受操作方法的影响．近年来大量的 分子生物学技术应用于肠道微生态的研究，使我们对肠道微生物有了更完整的评价，对肠道中不能 Restriction 培养的细菌的研究在增加．其中，末端限制性片断长度多态性(Terminal FragmentLength 6S Restriction FragmentTRF)分 Polymorphism．T-RFLP)，又称1rRNA基因的末端限制性片段(Temainal 析技术，具有非常广阔的应用前景。该技术建立在PCR的基础之上，综合了DNA限制性酶切技术、 荧光标记技术和DNA序列自动分析技术，是RFLP(Restriction FragmentLength 的延展．它克服了传统微生物培养方法的限制、应用快速、灵敏度高且输出定量的数据结果．已被 成功的应用到了茵种鉴定、微生物群落的对比分析、微生物群落多样性及结构特征等领域． 1微生态学 1．1微生态学研究的主要内容 微生态学是研究正常微生物群之间、正常微生物群与人体动植物体内环境之间、人体动植物体 与外界环境之间三者相互关系的多学科相互交叉的一门新兴边缘学科，具有独特的理论和细胞、分 子水平的方法学。 1．2应用于微生态学研究的分子生物学 j 由于传统的微生物实验技术限制了它所涉及的研究领域，对于微生物的分类定位和种群关系很难进 行精确的定位，对肠道等机体部位微生物不能有完整的评价，对不能培养的细菌研究不够。为了克服这 样一个困难，科研人员采用了技术逐渐成熟的分子生物学相关实验技术，进行微生物的一系列研究。 1．2．1聚合酶链反应法：Suau等用针对16S rRNA的细菌域通用引物，’采用聚合酶链反应(PCR)法特 rDNA片段。对这些片段进行测序和种系 异性扩增粪便标本的DNA，得到284个平均长度500bp的16S 分析发现，284个16SrDNA片段对应于82个分子菌种，其中95％的片段对应于三类细菌：类杆菌、 球形梭菌、柔嫩梭菌。只有24％的克隆与目前已知能培养的细菌相对应，而将近76％的扩增得到的 ．rDNA序列与已知的细菌不一致，可能是肠道中迄今为止未知的细菌。因此，他认为，直接对粪便标， 本分析16S pCR技术对其进行扩增，分析到有16个不同长度的片段。 1．2．2变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳：变性梯度凝胶电泳([X3GE)是一个遗传指纹技术。首 先从胃肠道标本中提取DNA，再用通用引物PCR法扩增16SrDNA。扩增产物包含了这个标本中存在 的所有细菌的16SrDNA片段。不同细菌的16SrDNA片段通过DGGE凝胶时，可以在不同的尿素和甲 酰胺浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中发生部分变性，迁移速度明显下降，从而加以分离。16SrDNA片 段的分离产生了一个细菌群体的图谱，每一个DNA片段类型代表一个菌种。温度梯度凝胶电泳(1．GGE) 与DGGE机制相同，不同的是凝胶中所采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯度而是温度梯度。DGGE凝胶 rRNA探针结合鉴定特异性的种