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木薯SRAP 扩增体系的建立与优化 作物遗传育种 杨龙 分子标记技术 研究背景 材料与方法 分析 讨论 研究背景： SRAP 是一种新型的基于PCR 的标记系统，由Li与Quiros（2001）提出，又叫基于序列扩增多态性(sequence based amplified polymorphism，SBAP)。该标记通过独特的引物设计，达到对ORFs （open reading frames）进行扩增的目的。SRAP 是近年来发展起来的一种新型分子标记系统，它具有简便、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点。SRAP 标记中，引物的设计是关键，它是基于2 个引物的扩增，上游引物长17bp，对外显子进行特异扩增，下游引物长18bp，特异扩增的是内含子及启动子区域由于个体不同以及物种之间的内含子、启动子之间间隔长度不同而产生多态性。2 个引物均由5‘ 端14~15bp 的核心序列，和3’端3 个选择性碱基组成，其中核心序列又10~11bp 的无特异性的填充序列以及CCGG（正向引物中），或AATT（反向引物中）组成。且正向和反向引物中的填充序列必须不同。扩增的过程采用复性变温法，前5 个循环复性温度为35℃，后30~35 个循环则为50℃，扩增后的DNA 片段可用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，EB、银染或放射自显影检测。 SRAP 标记最早是在芸薹属作物中开发利用，目前已在花生、黄瓜、辣椒、小麦、甘薯、棉花、西瓜、油菜等植物中使用，应用于植物种质资源鉴定评价、种缘进化关系、遗传图谱构建、基因定位、重要性状标记以及比较基因组学方面。 实验材料 实验试剂 分析讨论 实验方法 1.试验时间、地点： 试验于2007 年10 月在中国热带农业科学院，热带生物技术研究所进行。 2.试验材料及试剂： 试验材料为木薯华南六号（SC6） 和面包木薯（MB）杂交一代的自交F2 群体，由热带生物技术研究所分子育种组提供。CTAB 法提取DNA。 实验材料 1.SRAP 引物由上海生工合成，32 对正向引物和21对反向引物。 2.所需PCR 试剂：Taq 酶、dNTP、10xPCR buffer 为申能博彩产品，DNAMarkerDL2000， 琼脂糖购自TIANGEN 公司。 实验试剂 1.根据Li 和Quiros 应用于蔬菜上的反应扩增程序： 94℃ ， 预变性5min， 然后， 先按94℃ 变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min 的顺序，进行5个循环，然后将退火温度升至50℃，其它温度仍然不变，再进行35 个循环；最后，72℃再延伸5min。 2.本试验在此程序基础上用PCR 方法分析DNA、aqDNA 聚合酶、dNTPMixture、primer 的浓度及变性温度、复性温度、延伸时间和循环数对扩增结果的影响。 3.扩增产物采用2%的Metaphor 琼脂胶进行平板电泳，胶中加入0.3μg/ml 溴化乙锭(EB)，梳子厚度1mm。取9μl 样品点样，用0.5 倍TBE 缓冲液，在100V 电压下电泳2h，用凝胶成像系统进行结果显示。 实验方法 结果分析 DNA浓度的确立 1.在10μl 体系中利用引物me12 和em6 进行SRAP 扩增。 2.结果表明（图1）：10~80ng 模板扩增的SRAP 产物几乎完全一致，没有明显的差异，SRAP 产物基本保持不变，这与在其他作物上的研究结果基本一致。又这说明SRAP 扩增对模板DNA 的浓度范围可以较宽。通过比较，选用30ng 为最佳模板量。 3.模板DNA 对PCR 结果有很重要作用，模板DNA用量过少，会减少引物与模板DNA 结合的机率，降低扩增效率，导致扩增的产物量少，检测时条带淡或无条带；用量过大，会增加非特异性条带，另外也会增加模板DNA 之间配对的机会。 结果分析 TaqDNA 聚合酶用量确定 1.本试验在10μl 体系中分别设定TaqDNA 聚合酶（5U/μl）4 个浓度梯度为0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl。扩增结果经琼脂糖电泳检测结果表明，TaqDNA 聚合酶使用0.1μl 时条带较暗，TaqDNA 聚合酶为0.2μl、0.3μl、0.4μl 时条带明亮、清晰（图2）为节省起见，所以本研究确定使用10μl 体系中TaqDNA 聚合酶为0.2μl。 2.TaqDNA聚合酶的用量过大会造成浪费，并且会导致非特异性扩增；用量过小，会影响扩增效率，降低扩增产物的产量。 结果分析 引物浓度的确定 本试验在10μl 体系中分别设定引物（50ng/L）6 个浓度梯度为0.1μl、0.3μl、0