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辣根过氧化物酶标记抗体技术及应用进展 实验原理 酶制剂及其底物 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶 (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一 般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下: 　　　　　　　　　　　　　　　HRP 　　　　　　　　DH2＋H2O2────→D＋2H2O 　　供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为 不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早 期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联 甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且 由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD (邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿 色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前 者可高4倍以上。 另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺 酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面， ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。 　　由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应 控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间 也不会增加反应产物的颜色。 HRP标记抗体的方法 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结 合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法 1.　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共 价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2.　标记步骤： (1)　称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 　　(2)　反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分 钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅 拌。 　　(3)　将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 　　(4)　用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。 (5)　加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 　　(6)　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (7)　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 少量0.15M PH7.4的PBS中。 　　(8)　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用 萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保 存。 　3.　结果判定： (1)　定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作 双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。 最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选 择)。 　(2)　定量和克分子比值测定： 　　(2)　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 　　酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.