植物组织培养教程 李浚明7.ppt

第七章 植物花药和花粉培养 植物单倍体培养方法: 花药培养、花粉培养 胚珠或子房培养（未受精） 植物花药/花粉培养历史 Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养 Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养） Chu（1973）小麦花粉培养 （早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低） 80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功Konzak (1999) 。 概念： 花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。 两者的异同点 培养目的相同，均获得小孢子植株。 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。 花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。 花药或花粉培养的作用： 花粉孢子体发育途径（雄核发育） 一、花粉发育的阶段 二、雄核发育途径 1、雄核发育与P花粉的形成 P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉） 2、雄核发育与饥饿处理 饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。  1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。 胚状体发育途径 通过胚状体途径再生形成小植株 胚状体发育途径 愈伤组织发育途径 花药和花粉培养方法 一、花药培养 二、花粉培养 三、白化苗现象 （一）白化苗产生的影响因素及机理 1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。 2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。 （二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。 四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素 芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 1、高低温处理 低温预处理：指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。处理温度一般在1-14℃，时间从几小时至几十天不等。不同作物所用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。 例子:小麦穗子培养前4℃预处理几天，花药培养效率显著提高。 十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9℃处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降为10.47个。  高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（30-35℃）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。 例子:如烟草，32℃高温；小麦，33℃高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（Touraev，1996） 2、化学物质处理 包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。 单倍体植株鉴定和染色体加倍 一、倍性鉴定 （为什么要进行倍性鉴定？） 1、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。 2、间接鉴定 （1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。 （2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 （3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。 （4）杂交鉴定法 自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 （5）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等） 二、染色体加倍 （为什么要进行加倍？） （一）茎段培养 将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。 二、染色体加倍 （为什么要进行加倍？） （