植物组织培养教程 李浚明8.ppt

第一 节 植物细胞培养 单细胞培养 细胞的悬浮培养 一、单细胞培养（通常以叶片为材料） （一）单细胞的分离 分离方法：机械法和酶解法。各有优缺点。 （二）单细胞培养 对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。 培养方法：平板培养、看护培养、微室培养、条件培养基培养法。 二、细胞的悬浮培养(cell suspension culture) 是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。 适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础。 第二节 植物细胞培养的应用 一、植物次生代谢产物的生产 二、突变体的选择 三、诱导多倍体 四、生产人工种子 第三节 植物原生质体培养及细胞融合 植物原生质培养和细胞融合可用产生远缘杂种； 是目前植物细胞及基因工程的核心技术。 自1970年首次获得烟草原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。 思考题： 1、有关名词解释 2、简述分离细胞的方法。 3、单细胞培养的基本方法有几种？ 4、简述植物原生质培养及细胞融合的作用。 2. 制备原生质体的酶类： 高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择材料和消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。 常用的酶类有： A. 纤维素酶，如Onozuka R—10及RS，国内常用的为EA3—867，其中含少量果胶酶； B. 果胶酶，如Macerozyme R—10 又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y—23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0．1％，悬浮细胞为0．05％； C. 崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性； D. 半纤维素酶，如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离; E 蜗牛酶，主要用于体细胞原生质体分离。 酶液配制： 需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0. 1mmol/l一10mo1／l)及KH2PO4 (0. 75mmol/l)等渗透稳定剂，以维持原生质体完整性。 酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其pH分别以5.4及5.8为宜；混合使用时pH5.4-pH5.6为宜，降至4．8以下则原生质体破裂。酶液配制后需以0.45 um微孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭菌法。 3．原生质体分离及纯化 （1）分离： 原生质体分离有机械法及酶消化法，前者产量极低而不多用、后者又分一步法及二步法。 一步法是将材料在2l一28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理2—24h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。 （2）纯化 A. 沉降法: 原生质体混合物经微孔过滤后，低速（150g）离心5min, 沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶液反复洗3-4次，后用培养液洗涤备用； B. 飘浮法: 离心法纯化的原生质体若含较多碎片及少量老细胞时．可用20％蔗糖离心，原生质体浮于液面．碎片及老细胞沉降而得以纯化，纯度高，但产量低； C. 不连续梯度离心法：将原生质粗提液置于不连续浓度梯度的溶液中，经离心后分离不同比重的原生质体。 4．原生质体活力测定 纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。 （1）根据形态待征判断其活力：原生质体呈绿色（若来源于叶片）及圆而鼓者为活原生质体。 （2）荧光染料活体染色法：荧光素染料可自由透过细胞膜，在细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自由透过细胞膜而滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原生质体死活。 （3）酚藏花红染色法：活原生质体能吸收呈红色，无活性的则不能吸收而无色。 （二）原生质体培养： 1. 培养方法： （1）固体培养：平板培养法，1. 2%琼脂。 （2）液体培养： A. 浅层培养法: 其过程是将1m1原生质体悬液置于直径4cm培养皿或25m1三角瓶中使成薄层后于培养箱中培养．初期振摇1—2次，防止粘壁； B. 固液结合培养法：在混好原生质体的固体培养基表面加一层相同成分的液体培养基进行培养。效果较好。 2. 培养条件： 密度： 平板培养103~104个/ml, 液