遗传病与肿瘤的基因诊断从DNA水平上寻找确诊遗传病的.pdfVIP

中国试剂网 3.17.3.13.17.3.1 遗传病与肿瘤的基因诊断 从 DNA 水平上寻找确诊遗传病的指标或探讨遗传病和肿瘤的病因等方面，已取 得很大成绩，这对产前诊断，早期确诊和突变基因携带者的检出等都有重要意义。 所用的方法大体有以下几种。 一、分离基因进行结构分析 利用 DNA 离体转化，制备探针，制备基因文库进行筛检，最后鉴定载体中 插入 DNA 片段的特性等一系列技术，可以设法分离出目的基因或某一特定的 DNA 顺序。然后通过 DNA 核苷酸顺序分析可以弄清楚某些疾病的病因。比如， 人体癌基因的分离和研究癌基因同原癌基因在 DNA 的结构与功能上的差别，对 了解细胞癌变的机制起了很大的作用。分离目的基因或专一DNA 顺序更常用的 是制备分子杂交探针，通过 Southern 印迹杂交或 Northern 印迹杂交等，了解某 些遗传病患者基因结构上的差别，从而找到可靠的诊断方法。比如，患者的基因 是否缺失，重排以及是否存在限制性片段长度的多肽现象等。 二、DNA 限制性片段多态性连锁分析 DNA 限制性片段长度多态性（restricition fragment length polymorphism, RFLPs ）连锁分析法是指由于缺失、重排或碱基置换的结果，使 DNA 分子中原 有的某种限制性内切酶的识别位点发生改变，或是消失或是增加，所以酶切后生 成的 DNA 片段的长度也随之改变。这种 DNA 限制性片段长度的变化往往同某 种疾病的连锁关系，因而可作为这种疾病的诊断指标。 如果所分析的 DNA 分子不太大，比如人体线粒体 DNA ，长 16569bp。在这 种 DNA 分子上每种限制酶的识别点不过几个到几十个，因此，当某种限制酶的 识别点发生改变并经过这种酶切后，可清楚地看到 DNA 电泳带的图型发生改变， 条带或者增加或是减少，条带所处的位置也有变化。可是，遗传病病例分析时所 用的是基因组 DNA ，而基因组DNA 从限制酶酶切后至少会生成 100 万个片段， 多的可达 1000 万个片段。如果其中有一、二个片段发生改变，不可能从电泳凝 胶上直接观察分辨。此时就必定要用合适的探针。某个目的基因或某一特定的 DNA 片段，在同酶切后的 DNA 作分子杂交后，可在曝光的 X 线片上看到 RFLP 。 图23-8 是用分子杂交法检测 RELP 示意图。 3.17.3.1 图23-8 分子印迹杂交法则 RFLPs 的示意图 这是通过限制酶 A 识别点的改变出现 DNA 的 RFLP ，再以合适的 DNA 片 段作为分子杂交的探针，在探针上标记了放射性同位素，同分别经酶 A ，酶 B 完全酶切的 DNA 作印迹杂交。在曝光后的 X 线片上可看到不同的杂交带图型。 ①是正常个体，经酶 A 和酶 B 切后的 DNA 同探针杂交，都只看到一条带。②是 一个杂合子即隐性突变基因携带者的杂交图式，由于它的一条染色体的 DNA 分 子中酶 A 的识别点发生改变，酶切后的DNA 片段较原来的长，所以出现一长一 短两个片段。③是突变基因纯合子，也就是患者，酶 A 和 B 的酶切片段虽然是 各有一个，但 A 的片段比正常的个体长，所以杂交带出现的位置也有改变。从 图 23-8 可以看出研究 RFLP 的两个重要因素，一是要制备合适的探针，二是要 用尽可能多的各种限制性内切酶进行酶切和杂交。 1974 年首次用 RFLP 作为遗传学分析的方法。1978 年简悦威和 Dozy 等第一 次用人体 β珠蛋白基因作为探针，同限制酶 Hpa Ⅰ酶切的DNA 做杂交，发现了 DNA 的RFLP 与镰形细胞贫血之间的关系（表 23-4 ）。 表 23-4 DNA 的RFLP 与镰形细胞贫血的关系 Hpa Ⅰβ珠蛋白基因片段（kb ） 13.0kb 片 Hb 基因型 总计