重组AAV病毒的转染方法.pdfVIP

本元正阳基因技术股份有限公司 国家高技术计划病毒基因载体研发基地 重组 AAV 病毒的转染方法 目录 1. 注意事项 2. 体外转染 2.1 建议用量 2.2 报告基因的应用 2.3 rAAV2/EGFP 体外转染 BHK-21 细胞 2.4 增强表达的方法 2.5 转录产物的检测 2.6 表达产物的检测 3. 体内转染 3.1 建议用量 3.2 报告基因的应用 3.3 转录产物的检测 3.4 表达产物的检测 1. 注意事项 1.1 在应用 rAAV 的过程中注意安全防护，最近的NIH 的声明中陈述“任何不表达具有致癌性 和毒性蛋白的野生和重组腺相关病毒载体（血清型 1-4），如果不含有辅助病毒的污染，其生 物安全性级别为 I 级（最安全）。” 1.2 5%酚或 10%漂白剂可以杀灭腺相关病毒，我们建议应用 10%漂白剂来处理腺相关病毒的环 境污染。 2. 体外转染 2.1 建议用量 5v.g./cell 。即病毒基因组数（v.g ）与转染细胞数之比 建议 moi （multiplicity of infection ）为 10 5 为 10 。 地址：北京经济技术开发区永昌中路 6 号 1 邮政编码：100176 电话：010 传真：010 网址： 本元正阳基因技术股份有限公司 国家高技术计划病毒基因载体研发基地 2.2 报告基因的应用 本 公 司 提 供 以 下 含 报 告 基 因 的 重 组 AAV 病 毒 载 体 ： rAAV2/GFP ， rAAV2/EGFP ,rAAV2/luc ，rAAV2/lacZ （见产品目录）。 用不同剂量的含报告基因的重组 AAV 病毒载体转染实验细胞，并以敏感细胞（如：293 、 BHK-21 ）为对照，24~48hr 以后对报告基因的表达进行观察或检测。可用辅助病毒如5 型腺 病毒或丁酸钠增强表达水平，以便于观察或检测。 根据实验结果作出以下判断： a. 实验方法是否正确。 b. 实验细胞是否能被有效转导。 c. 最佳转染剂量。 2.3 rAAV2/EGFP 体外转染 BHK-21 细胞 2.3.1 材料 细胞株： BHK-21 细胞（金黄地鼠肾细胞），购自美国 ATCC 并由本公司保存。 重组 AAV2 病毒：rAAV2/EGFP 由本公司生产，滴度为 1×1012v.g/ml。 试剂：RPMI1640 液、胎牛血清、丁酸钠或 5 型腺病毒（Ad5）。 24 孔细胞培养板。 2.3.2 方法 BHK-21 细胞按 5×104 个/孔接入 24 孔板，共 8 孔，其中 2 孔留作细胞计数用。培养液为含 10％胎牛血清的 RPMI1640 液,37℃ 5% CO2 培养箱培养 12hr。 观察细胞状态是否正常，计数细胞。用无血清的 RPMI1640 液将细胞洗两遍，洗细胞时注意 动作必须轻柔，以免细胞脱落。 4 5 5 按 MOI 值(v.g./cell)分别为 2×10 、1×10 、5×10 计算所需加入 rAAV2/EGFP 病毒的体积 数，在试管中将需加入的 rAAV2/EGFP 病毒与无血清的 RPMI1640 液混和。 将上述 rAAV2/EGFP 病毒与无血清的 RPMI1640 液混合液分别加入每孔细胞中，每孔细胞加 200ul。并作复孔。将孔板置于 37℃ 5% CO2 培养箱培养。 1hr后，吸去每孔液体，加入1ml/孔含10％胎牛血清的RPMI1640液，可同时加入10-50mmol/l 的丁酸钠或加 1-5 MOI 的 5 型腺病毒，以增强其表达。 地址：北京经济技术开发区永昌中路 6 号 2