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发酵过程及优化实验 ——产淀粉酶细菌的优化实验 班级：08生工1 姓名：顾婷婷 学号：060508138 一、实验目的 1.温故配制微生物培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤；了解鉴别性培养基的原理，并掌握配制鉴别性培养基的放到和步骤。 2.了解分批培养时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法。 3.掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，掌握在微生物分批培养时酶活力测定的基本方法。 4.了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出实验菌株的最佳培养条件。 5.掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。 二、实验原理 鉴别性培养基是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。如对于淀粉酶产生菌的筛选，选用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物，滴加碘液进行染色，若出现透明圈，则表明该菌能产生胞外淀粉酶。 将少量微生物接种到一定体积的新鲜培养基中，在适宜的条件下培养，定时测定培养液中微生物的生长量（吸光度或活菌数的对数），以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制的曲线就是生长曲线，它反映了微生物在一定环境条件下的群体生长规律。依据生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。这四个时期的长短因菌种的遗传特性、接种量和培养条件而异。因此，通过微生物生长曲线的测定，可了解微生物的生长规律，对于科研和生产实践都具有重要的指导意义。 本实验采用比浊法来测定。由于菌悬液的浓度与吸光值（A）也称光密度成正比，只要用分光光度计测得菌液的A后与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌株的生长曲线。 产物形成曲线就是产物产量对培养时间的曲线。学会生长曲线和产物形成曲线的测定对工业发酵具有非常重要的指导意义。 淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失 ，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高。 培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。发酵培养基中的原料多是大分子物质，微生物一般不能直接吸收，必须通过胞外酶的作用后才能被利用，所以是一些“迟效性”营养物质。而微生物分泌的胞外酶有不少是诱导酶，为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖，可适当在培养基中添加一些速效营养物。 三．材料与器材 菌种 枯草芽孢杆菌 2. 培养基 普通培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。 鉴别型培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g， NaCl 5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。 3. 器皿：电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，移液管，pH试纸，棕色瓶，容量瓶，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，分光光度计，摇床，恒温水浴锅等。 4.药品：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，蒸馏水，可溶性淀粉，琼脂，NaOH, 碘化钾，碘，十二水合磷酸氢二钠，柠檬酸，乙酸，葡糖糖，果糖，蔗糖，乳糖。 5.试剂 碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。 比色稀细碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。 2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，倒入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100mL。须当天配制。 pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100mL。 0.5mL/L乙酸溶液，0.85%生理盐水。 6.其他：药匙，记号笔，报纸等。 四、方法和步骤 （一）．培养基的配置、灭菌 1. 配制基本培养基1500ml , 分装50mL至250mL锥形瓶，共23瓶，供实验菌株扩增。 2．配制鉴别培养基（可溶性淀粉10g/L和15g/L两种）各100ml，检测实验菌株是否能产胞外淀粉酶。 3．配制稀释用的生理盐水，分装4.5mL至每个试管。 3．包扎培养皿、锥形瓶，移液管等。 4．121℃，灭菌20min。 （二）生长曲线的测定 1. 将实验菌株经过适当稀释涂布在鉴别性培养基上培养2天，在菌落周围滴加碘液，根据透明圈的大小，挑取合适的单菌落进行后续实验。 2. 将选择的菌挑取到