体外新鲜人全血法检测两种中药注射液热原物质探讨.pdfVIP

第十一届(2014年)学术研讨会 体外新鲜人全血法检测两种中药注射液热原物质的探讨 王文佳，陈志明，庞智慧，方海顺，何华红，张汉斌，李薇 (广州市药品检验所广州，510160) 摘要：目的探讨体外新鲜人全血法检测中药注射液中热原物质的可行性，并优化该方法。方法用新 鲜人全血模拟人体，将不同浓度的热原标准品(细菌内毒素标准溶液)和受试品加入稀释血液中孵 血液进行稀释，比使用灭菌生理盐水稀释结果更灵敏；2、稀释液中是否加入胎牛血清则对结果无 明显影响；3、稀释血液按1—4的稀释倍数配制结果更灵敏；4、稀释血液和受试物加样比例为4：l 较合适；5、血液在4℃保存26 h内，仍存在较好的量效关系；6、初步结果表明该法可应用于中药 注射液(如清开灵注射液和金纳多注射液)的热原检测。结论本研究表明外新鲜人全血法可应用于 中药注射液的检测，本文为外新鲜人全血法检测条件的优化提供实验依据。 关键词：热原：lL-lB：体外试验；中药注射液 目前，现行《中国药典》热原物质检查收载了家兔法和细菌内毒素检查法(ne ＆蛐rial 药典所采用，但该法只能定性，不能定量和标准化，重复性差，灵敏度低，且使用活体 动物，费用高，不符合3R原则【1】。BET法通过鲎血细胞与细菌内毒素结合形成凝胶反 应来检测，具有快速、灵敏、可定量等特点，但它只能检测细菌内毒素，而对其他外源 性热原物质不能检测【2】。由于以上两种检测方法存在一定的不足，且涉及动物伦理问题， 国外有许多关于热原物质检查新的体外替代实验的研究，《欧洲药典》7．O版已经收纳的 Activati哑Test，MAT)【3】o 单核细胞活化试验方法(Monocyte 体外试验使用新鲜人血模拟机体反应，进行热原检测，是进行新方法研究的依据。 免疫细胞经外界刺激后产生内源性热原，即相关细胞因子，如见．1B、IL．6、n虾一oc等。 这些细胞因子通过直接或间接进入下丘脑视前区体温调节中枢系统，调节体温【。】。通过 ELISA对相关细胞因子进行检测，可间接反映外源性热原的存在和含量。此方法能真 实地模拟人体发热反应，消除种属差异，提高实验结果的准确性。本研究使用不同浓度 的细菌内毒素标准溶液加入稀释的新鲜血液中，孵育后采用EUSA测定血液中释放的 Ⅱ广1p因子，通过对该方法检测条件的研究，以期优化该方法，并对两种中药注射液进 行初步方法的研究。 l材料与仪器 院，规格：70 EU·支。1)；人IL-1p 生物制品有限公司)：胎牛血清(f-etal ．15R． 第十一届(2014年)学术研讨会 剂有限公司)；氯化钠注射液(130524，北京双鹤股份有限公司)；RPMlMedium1640 (批号：1487360，美国Life 台湾生化学制药股分有限公司)。 国Molecular 原24孔细胞培养板等(Costar)；试验用玻璃器皿采用干热灭菌法(250℃加热30mins)。 1．3血液 1．3．1健康献血者，至少一周内无感染(如细菌、病毒)，并且7天内未服用过类固醇药、 抗炎药或对免疫系统有抑制作用的药物【3】。 1．3．2取无热原含肝素钠抗凝剂的采血管采集新鲜人血，在无菌条件下加入100U·IIll‘· 青霉素和链霉素。 1．3．3使用血球计数仪对血液进行血常规测定，观察血细胞是否在正常范围内。 2方法 2．1细菌内毒素工作标准品溶液的配制加入1．OInJ细菌内毒素检查用水复溶细菌内毒素 mins后，用舢Medium1640培养液(以下简称1640 工作标准品，漩涡振荡器混匀15 EU·棚～、O．8EU·m1．1、O．32EU佃1．1口 EU·Illl～、2 培养液)稀释到5 U雠1．1 22血液取无热原含EDI．A抗凝剂的采血管采集新鲜人血，在无菌条件下加入100 青霉素和链霉素13】。新鲜人血4℃保存。使用血球计数仪浏血常规。 2．3稀释液和稀释倍数的研究【5．61