淫羊藿苷和黄芪甲苷对皮质酮所致原代培养海马神经元损伤的保护作用及研究.pdfVIP

淫羊藿苷和黄芪甲苷对皮质酮所致原代培养海马神经 元损伤的保护作用研究 复旦大学附属华山医院刘宝君董竞成1张红英 摘要目的探讨淫羊藿苷和黄芪甲苷对皮质酮诱导的原代培养海马神经元损伤的保护作 用。方法采用皮质酮诱导原代培养海马神经元建立神经元损伤模型。采用MTT法和LDH 释放法检测神经元存活率；倒置显微镜下观察神经元的生长发育形态；采用Caspase一3分光 细胞存活率均接近15％，且呈浓度和时间依赖性下降。淫羊藿苷能明显减少皮质酮干预后 的神经元的损伤，与对照组相比有显著性差异(pD．01)。给与10。6mmol／L淫羊藿苷干预 后，与模型组比较，核固缩的神经元比例大幅降低。caspase．3检测结果显示，模型组较空 相对活性有极显著的降低(P0．01)。而与模型组比较，黄芪甲苷组无显著差异。结论淫 羊藿苷对皮质酮诱导的原代培养海马神经元损伤具有保护作用，其可能与抑制神经元凋亡 无关。而益气药黄芪甲苷无明显保护作用。 关键词淫羊藿苷；黄芪甲苷；皮质酮；海马神经元；凋亡 axis)持续反复激活导致 下丘脑一垂体一肾上腺轴(Hypothalamic—pituitary—adrenal，HPA J．从而引起学习记忆能力下降，以及焦虑、抑郁等 receptor，GR)，更易受到GC的损伤[I’2 情感障碍。同时临床上对于罹患严重感染、自身免疫性疾病、肾病综合征等疾病的患者往 往需要应用大量糖皮质激素，而对于其可能引起的海马损伤等，现代医学目前尚缺乏有效 的治疗手段。因此从天然中药中寻找一种抗皮质激素性神经元损伤药物具有重要的科学意 义和应用前景。我们的前期研究表明，补肾益气中药淫羊藿、黄芪可改善哮喘大鼠的HPA 上海市科委中药现代化专项(NO．10DZl974000) 作者单位：复旦大学附属华山医院中西医结合肺、炎症、肿瘤研究室 通讯作者：董竞成，Tel：021E-mail：jcdon92004@126．com 药淫羊藿苷能够保护皮质酮所致的神经元损伤。为了进一步研究补肾益气药保护神经元损 伤的作用机制，本实验采用皮质酮干预原代培养海马神经元，研究对比补肾药淫羊藿苷和 益气药黄芪甲苷对皮质酮所诱导的原代培养海马神经元损伤的保护作用差异，旨在阐明补 肾药和益气药在神经元保护方面的作用，为临床上进一步寻找抗皮质酮性神经元损伤提供 理论依据。 材料与方法 1．材料 许可证号：SCXK(沪)2007—0005。 1．2药物淫羊藿苷和黄芪甲苷购自上海融禾医药科技发展有限公司。corticosterone (Purity92％)购自sigma公司。 Medium、B27 1．3．试剂和仪器Neuronbasal—A 细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。LDH细胞繁殖与毒性定量 检测试剂盒购自GENMEDSCIENTIFICSINC．USA。 2．方法 2．1海马神经元培养 取新生24h以内的SD大鼠，常规消毒并处理后，暴露两侧大脑半球，取大脑组织放入 冰冷的无钙镁HBSS；去除小脑及嗅球部分，用弯镊取出下丘脑，沿中线分开两个大脑半 球，置于解剖显微镜下取海马；用两把纤维镊分离脑于，完全去除脑膜，分离皮层组织， 即可见弯月形的海马，镜下去除微血管，将海马置于冰冷的另外一个HBSS培养皿中；收 集所有海马组织后，用弯剪剪碎海马为lmm3大小，用吸管转移至15ml离心管中；加入同 洗3次；加入预热的种植液2ml，用玻璃滴管反复吹打10余次，避免产生气泡，再换用细 口径滴管反复吹打10余次，静置5min，吸取上清到新的50ml离心管中；台盼蓝染色计数， 吸取looU1细胞到EP管内，加入100lJl台盼蓝染色液，混匀，染色3min，细胞成活率在 板中；24h贴壁后完全换液为饲养液，抑制胶质细胞生长，3天后半量换液，7天用于实验．。 2．2药物处理 神经元培养第7天，用预热的无钙镁的HBSS清洗1次，分为：对照组，不同浓度皮质 酮干预组，皮质酮+不同浓度淫羊藿苷组，皮质酮+不同浓度黄芪甲苷组，淫羊藿苷或黄芪 甲苷预处理2h，对照组用相同体积的DMSO，终浓度为0．1％。这个浓度对神经元是无毒 性的。然后和皮质酮共孵育24h。淫羊藿苷和黄芪甲苷浓度根据MTT和LDH细胞毒性实