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免疫共沉淀原理及步骤 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理 IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的 “protein A/G特异性地结合到抗 体 (免疫球蛋白)的FC 片段的现象开发出来的方法。目前多用 protein A/G 预先结合在 argarose beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A/G 就能达到吸附抗原的 目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。 免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实 验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验 从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads 孵育；抗体-agarose beads 复合物洗涤到最后的鉴定， 每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 IP 实验步骤 基本实验步骤 (1)收获细胞，加入适量细胞 IP裂解缓冲液 (含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min，12,000g 离心 30 min 后取上清； (2) 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液将 1μg相应的抗体和 10-50 μl protein A/G-beads 加入到细胞裂解液，4°C 缓慢摇晃孵育过夜； (3)免疫沉淀反应后，在 4°C 以3,000 g 速度离心 5 min，将 protein A/G-beads 离心至管底； 将上清小心吸去，protein A/G-beads 用 1ml裂解缓冲液洗 3－4 次；最后加入 15μl 的2×SDS 加 样缓冲液，沸水煮 10 分钟； (4)SDS, Western blotting 或进行质谱分析。一、 样品处理： 免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的 抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原 是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads 孵育对免疫 沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者 4°完成外， 最为关键的是裂解液的成份。 用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的 RIPA 裂 解液为例 (主要含有 pH7.4 左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的 NaCl，一定比例的去垢剂和甘 油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目 的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。 a． 缓冲液：离子缓冲液常采用 pH7.4 的Hepes 或者 Tris-Cl。 b． NaCl 浓度一般习惯用 150 mM，这主要是因为 150 mM 接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的 相互作用。然而细胞内部的 NaCl 浓度并不是均一的，局部 NaCl 的浓度可以低到 50 mM，150 mM 的NaCl 有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl 浓度要视所分析 的蛋白的亚细胞定位而定。 c． 甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加 10%的 甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。 d． 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其中储存 的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以 保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而 恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止 目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非 常关键。一般主要通过添加 EDTA 抑制金属蛋白酶，通过 Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂 混合物)可以抑制蛋白酶。 e． 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类 和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果： - 细胞质/器膜的通透性：因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出 来，抗体才能与之反应。 - 膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对这类蛋白的免疫沉 淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。 - 蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋 白的特性进