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兽医生物技术实验手册 动物医学院 细胞生物学实验室自编手册 2010.11 目录 PCR技术及DNA凝胶电泳及PCR片段的纯化1 DNA限制性酶切反应、DNA酶切片段的回收与鉴定4 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA连接转化………………………7 质粒DNA的提取及鉴定……………………………………………...10 蛋白质的原核表达…………………………………………………….13 蛋白质电泳………………………………………………………...…..14注意事项 实验注意事项： 对所有样品进行严格标记，避免混淆 酶及蛋白等样品一定要低温放置 加样品时注意更换枪头，避免对试剂或样品的交叉污染 接触DNA荧光嵌入染料等有害物品时一定要戴手套 注意将反应样品混匀 实验室仪器使用注意事项： 使用离心机时，一定要注意平衡。 注意正确使用移液枪，设置量程时，禁止超过最大量程。 细菌操作注意事项： 中心原则： 1. 保护操作人员不受细菌感染。 2. 防止使用的细菌受到其它微生物（比如：真菌、其它细菌等）的污染。 本实验课使用的大肠杆菌均是经过人工改造，供实验室研究用的菌株。和野生型的菌株相比，这些菌株的毒力明显减弱，但仍应视为有害物质。尤其是我们使用的许多大肠杆菌均转入了表达抗生素的质粒，因此严禁将这些大肠杆菌释放到环境中。 注意事项： 在实验室里禁止吃喝，不要将笔、手指及其它任何物品放入口中。 如果不慎洒溅出了细菌液，需立即用纸将菌液吸干，并对细菌污染区域做消毒处理。 禁止用手直接接触菌液。 正确并及时标记所有培养细菌的试管和培养皿。 拿细菌培养试管时，不要只拿盖子部分，因为盖子盖的不紧，试管部分容易脱落，造成细菌污染。 如手等部位有伤口，应将伤口部位包扎好。 细菌液必须经过消毒处理之后，才能倒掉。 实验一、PCR技术、DNA凝胶电泳及PCR片段的纯化 实验原理： 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是利用两已知序列的寡核苷酸作为上、下游引物,在耐热性DNA聚合酶(Taq酶)作用下将位于模板DNA上两引物间特定DNA片段进行一种指数级增长的复制过程。PCR反应体系由模板DNA、引物、耐热性DNA聚合酶、底物(四种dNTP)、缓冲液和Mg2+等组成。其操作过程为变性、退火、延伸等三个步骤循环进行。其中变性是加热条件下模板DNA双链间的解离,退火是降低温度使模板DNA与高浓度引物间的互补结合,延伸是在耐热性DNA聚合酶和Mg2+等存在下扩增特定的DNA片段。每次循环扩增产物又可作为下一循环的模板,因此理论上每经过一轮变性、退火、延伸三个步骤,特定DNA片段的分子数目增加一倍。耐热性DNA聚合酶的应用使PCR循环反应可自动进行,提高了反应的特异性和效率。引物设计是PCR技术的关键步骤，直接影响扩增的效率和特异性。同时，通过适当改变引物的设计可实现多种PCR技术，现在利用计算机软件可辅助设计某一己知序列基因的特定引物。 PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术,具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在医学、分子生物学领域得到广泛应用，如应用于DNA克隆、突变分析、基因融合、基因半定量、遗传性疾病的诊断等方面。 DNA凝胶电泳常用的是琼脂糖电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的重要方法，该技术操作简便快速。其原理与蛋白质电泳基本相同。在pH高于其pI时，DNA分子带负电荷，在直流电场中DNA向正极泳动。不同的DNA分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的泳动速度存在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。电泳后的凝胶浸泡于荧光染料（如溴化乙锭Ethidium bromide 或Goldview）中，染料分子可嵌入DNA分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段所在的位置和亮度，从而对DNA进行定性或定量测定。 琼脂糖凝胶的浓度可根据DNA分子的大小来确定，一般基因组DNA可用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，质粒DNA选择1％琼脂糖凝胶，而对只有几百个碱基对的寡核苷酸可制备浓度更高一些的琼脂糖凝胶。除能确定DNA片段的大小外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。 实验步骤： （一）PCR PCR反应五要素引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（Mg2+)。 1. 在0.2ml离心管中配制反应体系；下面是一个μl的PCR体系供参考，可根据情况调整 实验管(μl) 对照管(μl) 10×Taq酶缓冲液 5 5 dNTP混合液(10 mM) 1 1 引物1 (10 nM) 1 1 引物2 (10 nM) 1 1 模板DNA 1 Taq DNA聚合酶(lU/μl) 1 1 去离子水