细胞培养..docVIP

实验一 细胞培养的准备工作 一、实验目的 掌握一定的细胞培养实验准备技术及其原理。熟悉培养用品的清洗与消毒原则初步了解无菌操作的基本要领和要求。认识细胞培养常规器材及其用法用途。1.新玻璃器皿自来水刷洗，除去灰尘。烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12以除去脏物、铅、砷等物。12小时后用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再洗涤剂刷洗，自来水冲干净后烘干。用（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗1次，蒸馏水冲洗3次最后蒸水过3次。烘干，后用牛皮纸包装。 旧玻璃器皿洗涤剂，自来水冲干净后烘干。金属器械自来水冲，75％酒精擦拭，放入铝制盒内橡胶2%NaOH溶液煮沸15~20 min，用自来水冲洗干净，再用1％稀盐酸溶液浸泡30 min，再用自来水冲洗，蒸馏水漂洗2~3次，最后三蒸水漂洗1次，高压，烘干备用。的胶塞自来水冲2~3次，最后三蒸水漂洗1次，高压，烘干备用。水中，洗涤剂浸泡并用超声波清洗机清洗，流水冲净，蒸馏水漂洗23次，最后三蒸水漂洗2次。将0.22μm高压，烘干备用。水中，洗涤剂浸泡并用超声波清洗机清洗，流水冲净，蒸馏水漂洗23次，最后三蒸水漂洗2次高压，烘干备用。注意事项1.严格执行高压锅的操作规程2.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体3.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水青霉素是80万单位/瓶，4ml蒸水。链霉素是100万单位/瓶，5ml，即每毫升各为20万单位。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml1单位＝1微克D-Hanks液：NaCl 8g，KCl 0.4gNa2HPO4·12H2O 0.1348g，KH2PO4 0.068g，葡萄糖1g加去离子水至1L，高压灭菌12115min。临用100m1加8. 8%NaHCO34m1。0.25%胰酶消化液的配制：Trypsi0.25g，D-Hanks液100m1配好后4静2~4h，过滤除菌。 5．装有传代用的细胞生长培养液，清洗液D-Hanks，0.25%胰酶，0.02%EDTA的容器拿入超净台内之前均用75%酒精擦拭灭菌。 7．吸出并弃掉培养细胞的旧培养液。酌情可用3-5ml的D-Hanks液洗去残留的旧培养液。 8．50ml培养瓶加入0.5ml胰酶，0.5ml 0.02%EDTA，轻晃混匀，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即于超净台中用新鲜的细胞生长培养液终止胰酶的消化反应。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。 9．再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液(7-10ml／每瓶，轻轻吹打制成细胞悬液，然后平均分装到另一个灭菌的培养瓶中（即每个培养瓶3.5-5ml细胞悬液）。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱，5% CO2，37℃进行培养。 五、注意事项 1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。 2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的D-Hanks或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 实验三 细胞的冻存与复苏 一、实验目的 掌握细胞保存的方法，能独立地进行细胞冻存与复苏操作。 二、实验原理 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂——二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入37-40℃热水中迅速解冻。 三、实验材料 1．实验用品：生长状态良好的细胞，细胞冻存液，冻存管，离心管，恒温水浴锅，75％酒精棉球。 2．实验药品：细胞生长培养液，0.25％胰蛋白酶，DF12（与细胞生长培养