631164_Tet-On_3G_诱导表达系统实验流程(clontech).pdf

Tet-On® 3G 诱导表达系统实验流程 Tet-On® 3G 诱导表达系统实验流程 一、 测验 共转染pTRE3G-GOI 载体和pCMV-Tet3G ( 比例1:4) HeLa 或HEK 293，或靶细胞。Dox诱导目的 表达之后，选择合适的特异基因分析方法进行分析目的基因的表达情况，例如： Western blot Northern blot qRT-PCR 基因特异性功能分析 或者，将pTRE3G-GOI载体转染Tet-On 3G cell line，来考察目的基因的表达情况。 1. 使用Xfect转染试剂将调节载体和应答载体共转染靶细胞 (在一个6-well板中进行)，参照Xfect 转染试剂使用手册(请登录/manuals下载说明书)。 每孔使用1 μg pCMV-Tet3G和4 μg pTRE3G-GOI 。建议设置实验组和阴性对照组：3个孔中添加 100– 1,000 ng/ml Dox，另外3个孔孔不添加Dox。 Wells 1 2: 1 μg pCMV-Tet3G and 4 μg pTRE3G-GOI (no Dox) Wells 3 4: 1 μg pCMV-Tet3G and 4 μg pTRE3G-GOI (100– 1,000 ng/ml Dox) Well 5: 1 μg pCMV-Tet3G and 4 μg pTRE3G empty (no Dox) Well 6: 1 μg pCMV-Tet3G and 4 μg pTRE3G empty (100– 1,000 ng/ml Dox) Figure 4.调节载体和应答载体转染六孔板中的靶细胞 2. 24 hr后，分别收集每个孔中的细胞团，根据GOI选择合适的方法比较诱导后的GOI表达水平和 未经诱导的GOI表达水平。 注意: 由于瞬时转染后的细胞比稳定转染的细胞内包含更多拷贝的TRE元件拷，瞬时转染实验中 的基因诱导倍数比稳定转染实验的低，瞬时转染实验中的诱导倍数只能有10-100倍。 二、 建立稳定表达转录激活子的细胞系 1.使用6-孔板中的1个孔接种细胞： 贴壁细胞: 转染前一天将细胞接种在1ml培养基中， 转染时的细胞密度应该达到50 –80% 。 悬浮细胞: 以细胞密度为5 x 10e5 –1.25 x 10e6进行铺板。 2.使用Xfect转染试剂和2ug 的pCMV-Tet3G (or pEF1α-Tet3G) 转染靶细胞，具体转染步骤详见 Xfect 说明书 (PT5003-2 ) 。 3. 48 hr后，将6-孔板中的细胞涂布到4个10cm培养皿中(不含 G418)。 4.再过48 hr后，加入最优浓度的G418 进行筛选，对于一般细胞来说，通常G418 的浓度在400–500 μg/ml 。 5. 每隔4天更换一次培养基。 6. 不含质粒的细胞会在3-5天后死亡。 注意: 避免二次传代细胞。 7. ~2 周后，G418抗性的细胞团开始出现。 1 Tet-On® 3G 诱导表达系统实验流程 8. 待细胞团足够大时，挑取24个健康的大细胞团分别放在24-孔板的各孔中进行培养。 9. 使用恒定浓度的G418筛选 (100–200 μg/ml) 。 当细胞团开始交汇时，将每个孔中的菌落平均 分到6-孔板的3个孔中。 三、 诱导表达检测Tet-On 3G克隆 1.诱导表达检测24个Tet-On 3G克隆，分别取1/3量的细胞团接种到6-孔板的1个孔中，共接种24个 6-孔板，正常培养。 2. 将剩下的2/3量的细胞团分成两份各接种到6-孔板的1个孔中，共接种48个6-孔板分A组和B组。 将上述48个样本过夜培养。然后向每个孔中加入5 μg pTRE3G-Luc和Xfect 转染试剂。 3. 4 hr后，给A组更换