附件2：间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）.doc

附件2：间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA) 1．操作步骤： 1.1 血清用PBS稀释液按1:400、1:800、1:1600、1:3200稀释。 1.2 取包被钩体抗原的酶标板，将稀释好的阳性血清、阴性血清及样本血清分别加入酶标板孔中，每孔100μl，同时加入2孔空白对照(PBS)。37℃ 60分钟，弃去孔中液体。 1.3 洗板，于酶标板每孔加入洗涤液250μl，洗板3次。 1.4 每支酶标羊抗人IgG用0.5ml三蒸水充分溶解均匀后，再用PBS按1:50 稀释，每孔加稀释好的酶结合物100μl。放置37℃ 40分钟。 1.5 洗板：洗板4次(方法同1.3)。 1.6 显色与终止：加底物液A、底物液B各1滴。室温避光显色，10分钟后，每孔加终止液1滴，终止反应。 1.7 采用波长405nm的酶标仪测定OD值，阴性OD值×2.1作为判定界值。检测样本的OD值≥此判定界值则为阳性。 2．试剂配制： 2．1 洗涤液(PBST，pH7.4)： NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 硫柳汞 0.1g D2H2O至 1000ml 2．2 稀释液(PBS，pH7.4): NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 硫柳汞 0.1g D2H2O至 1000ml 2．3 底物液A(0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液，0.06%过氧化氢脲，pH 5.0-5.4) Na2HPO4.12H2O 36.82g 9.2g 柠檬酸.H2O 10.21g 2.55g 过氧化氢脲 0.6g 0.15g D2H2O至 1000ml 250ml 2．4底物液B(3、3`、5、5`─四甲基联苯胺，TMB，作用时终浓度0.1mg/ml) 2．4．1 TMB贮存液 TMB贮存液(50mg/ml) TMB 150mg 二甲基亚砜 3ml 注意事项：TMB不易溶解，缓慢加入二甲基亚砜中并不断摇晃或搅拌，水浴适当加热可加速溶解。 2．4．2 底物液B 柠檬酸.H2O 1.05g 0.263 EDTA-Na2 (EDTA) 0.146g 0.0365g D2H2O至 1000ml 250ml TMB贮存液(50mg/ml) 4ml 1ml 2．5 终止液：2M H2SO4 2